一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。寄生蜂气味结合蛋白的制备方法包括以下步骤：一、淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白基因的获得，包括（1）提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；（2）设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；（3）将目的片段进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；（4）将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后进行培养；二、重组蛋白表达条件的优化；三、目的蛋白的分离纯化，包括菌体的收集、破碎；目的蛋白的分离纯化和浓缩。本发明专利技术得到的可溶性寄生蜂气味结合蛋白质量稳定可靠，对于研究其识别机制具有重要意义，具有较好的市场价值和社会价值。

A parasitic wasp odorant binding protein and its preparation method

The invention discloses a parasitic wasp odorant binding protein and a preparation method thereof. The preparation method of parasitic wasp odor binding protein includes the following steps: (1) the acquisition of the odor binding protein gene of Phyllostachys pallidus, including (1) the extraction of total RNA from adults of Phyllostachys pallidus, and the synthesis of the first chain of DNA; (2) the design and amplification of primers for the odor binding protein MpOBP8 of Phyllostachys pallidus parasitic wasps; (3) the extraction of total RNA from Phyllostachys pallidus adults and the synthesis of the The recombinant plasmid was transformed into expressing competent cell BL21 (DE3) and then cultured. Secondly, the expression condition of recombinant protein was optimized. Thirdly, the separation and purification of target protein, including collection and fragmentation of bacteria, separation and purification of target protein and concentration of target protein. . The soluble parasitic wasp odor binding protein obtained by the invention is stable and reliable, has important significance for studying its recognition mechanism, and has good market value and social value.

【技术实现步骤摘要】
一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法
本专利技术涉及生物工程方法
，具体是一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。
技术介绍
昆虫主要通过嗅觉识别外界的化学信号，化学感知在昆虫的觅食、交配和躲避天敌活动中，起着至关重要的作用。昆虫在长期的进化过程中，形成了一套精密的嗅觉感受系统，嗅觉感官主要分布在昆虫的触角上，通过触角能够感知外界环境的化学刺激。昆虫触角中高表达的气味结合蛋白(OdorantBindingProteins，OBPs)与嗅觉识别相关。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是一类分子量较小(15～20ku)，广泛存在于昆虫的化学感受器淋巴液中的酸性蛋白。其是昆虫与外界进行信息交流的媒介，与外界的气味物质进行相互作用，对于维持昆虫的生命活动起到重要作用。因此克隆得到气味结合蛋白对于研究其识别机制具有重要意义。淡足侧沟茧蜂MicroplitispallidipesSzepligeti是蔬菜夜蛾中低龄幼虫的优势寄生蜂，是甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜纹夜蛾Spodopteralitura田间种群数量的重要调节因子。淡足侧沟茧蜂在田间对寄生昆虫具有较高的寄生效果，田间自然寄生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；并在正、反向引物中分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶切位点核酸序列；正向引物序列：5′‑CGCGCGGGATCCATGGATTCAAATATAAAATATAT‑3′；反向引物序列：5′‑CGCGCGAAGCTTCTACTGGGTCATTTTCAGAGGC‑3′；以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳，回收目的片段；(3)将目的片段用内切酶Hind Ⅲ和BamH ...

【技术特征摘要】
1.一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；并在正、反向引物中分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制酶切位点核酸序列；正向引物序列：5′-CGCGCGGGATCCATGGATTCAAATATAAAATATAT-3′；反向引物序列：5′-CGCGCGAAGCTTCTACTGGGTCATTTTCAGAGGC-3′；以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳，回收目的片段；(3)将目的片段用内切酶HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；同时将pET32a(+)质粒用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切和纯化；纯化后的酶切产物在T4DNALigase体系下过夜连接；连接产物转化感受态菌株Trans1-T1并测序，将测序正确的样品提取质粒；(4)将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后接种于LB培养基中培养；然后再转接于LB培养基中；且做空载体pET32a(+)质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)的对照；(5)重组蛋白表达条件的优化；(6)目的蛋白的分离纯化；即得寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8。2.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，总反应体系为20μL，包括：5×RTReactionMix4μL，RandomPrimer1μL，HiFiH﹣RTase/RIMix0.8μL，RNasefreeH2O4.2μL，总RNA10μL。3.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增总反应体系为20μL，包括正反引物各0.4μL，10×Tagbuffer2μL，dNTPs0.4μL，TaqDNApolymerase0.4μL，cDNA2μL，ddH2O14.4μL；反应条件：94℃预变性10min，94℃30s，50℃30s，72℃1min30s；72℃延伸10min。4.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体为：将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后接种于10ml含氨苄青霉素50ug/ml的LB培养基中，在摇床37℃，200r/min的条件下，振荡培养10h；然后按1:100比例转接于50mlLB培养基中；且做空载体pET32a(+)质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)的对照。5.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(5)具体包括：通过检测培养液不同的OD600值；在不同的诱导温度、不同诱导持续时间和不同的IPTG诱导浓度条件下，SDS-PAGE分析寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的表达量，得出最佳诱导条件。6.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(6)具体包括：1)菌体的收集、破碎：离心，分别收集目的表达菌体及空白对照菌体；加入磷酸缓冲液PBS，将菌体悬浮，超声破碎；分别取目的表达菌体及空白对照菌体的全菌加入等量的2×SDS-PAGESampleBuffer混匀；再离心，分别取上清和经磷酸缓冲液PBS处理的不溶物加入等量的2×SDS-PAGESampleBuffer混匀；以上混匀后的各样品沸水浴处理；2)目的蛋白的分离纯化和浓缩：将超声破碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：季香云，杨安，蒋杰贤，张浩，万年峰，陈义娟，姚英娟，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31