幽门螺旋杆菌免疫优势表位肽L79-96及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫优势肽和核心肽，其组成如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.30所示。本发明专利技术所涉及的合适的CD4

Helicobacter pylori immunodominant epitope peptide L79-96 and its application

The present invention relates to a HLA-restricted CD4+T cell epitope immunodominant peptide and core peptide of Helicobacter pylori Lpp20, whose composition is shown in SEQ ID NO.10 and SEQ ID NO.30. Suitable CD4 for the invention.

【技术实现步骤摘要】
幽门螺旋杆菌免疫优势表位肽L79-96及其应用
本专利技术属于生物工程技术，具体是涉幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞免疫优势表位肽L79-96及其应用。
技术介绍
幽门螺杆菌(H.pylori)感染世界50％以上的人口，易导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤。越来越多的证据表明，CD4+T细胞反应在抗H.pylori感染中扮演一个关键的角色。有研究证实，H.pylori感染增加T细胞在人胃中的浸润并以典型的Th1表型存在，急性H.pylori感染主要引起恒河猴Th1反应，小鼠疫苗诱发的或宿主抗H.pylori的天然免疫依赖Th1型细胞反应。这些研究表明，Th1反应参与了宿主抗H.pylori感染的保护性免疫。免疫优势指在免疫或感染的个体中细胞免疫往往针对非常有限的抗原表位。一般来说，免疫优势T细胞不仅普遍存在，而且比亚优势细胞能提供更好的保护作用。因此，免疫优势T细胞被认为是在宿主抗病原体的适应性免疫中发挥更有效和关键的作用，这已经在许多细菌、病毒和肿瘤系统中被证实。许多疫苗研究领域的科学家认为免疫优势CD4+T细胞表位在H.pylori疫苗开发中至关重要。目前，尽管一些H.pylori保护性抗原的免疫优势CD4+T细胞表位已被鉴定，但是许多H.pylori抗原免疫优势特异性CD4+T细胞反应和免疫优势CD4+T细胞表位尚未阐明。Lpp20是H.pylori外膜脂蛋白，被认为是一个潜在的疫苗候选抗原。我们先前的研究鉴定了一个Lpp20的B细胞表位(L10-119)，可诱导小鼠产生抗Lpp20血清，还鉴定了两个H-2d限制性CD4+T细胞表位(L58-72和L83-97)，可诱发BALB/C小鼠分泌Th1型细胞因子。此外，以上述三种抗原表位构建的表位疫苗可引起特异性高水平的Lpp20抗体和Th1型细胞因子，显著降低H.pylori攻毒小鼠的H.pylori的定植，这表明Lpp20表位疫苗可能是一个有前途的防治H.pylori感染的疫苗。由于小鼠和人类的MHC分子存在差异，H-2d限制性的CD4+T细胞抗原表位有时不能在人类产生强烈的免疫反应。因此，鉴定Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位对人类H.pylori疫苗的设计非常重要。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一是提供一种幽门螺旋杆菌HLA限制性CD4+T细胞表位的多肽。实现上述目的的技术方案如下：一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫优势肽，其组成如SEQIDNO.14所示。一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫核心肽，其组成如SEQIDNO.36所示。本专利技术的另一目的是提供上述免疫优势肽或免疫核心肽在制备幽门螺旋杆菌表位疫苗中的应用。本专利技术的另一目的是提供幽门螺旋杆菌表位疫苗。实现上述目的技术方案如下：幽门螺旋杆菌表位疫苗，其活性成份包括或来自于上述免疫优势肽或免疫核心肽。目前，尽管目前已经鉴定了一些H.pylori保护性抗原的免疫优势表位，但有关许多H.pylori抗原的CD4+T细胞反应还尚不清楚。我们先前的研究鉴定了两个Lpp20的H-2d限制CD4+T细胞表位，以此构建的表位疫苗在小鼠预防和治疗性接种中抵抗H.pylori的感染，这种保护与Th1型Lpp20特异性CD4+T细胞反应密切相关。但是，MHC基因座是哺乳动物中遗传变异最大的编码基因位点，MHC分子的高度多态特性导致不同种类/对象的免疫系统产生针对同一病原/抗原的不同抗原/表位的免疫反应。这就是为什么许多候选疫苗在小鼠实验中取得成功，但在临床试验中失败。因此，本专利技术致力于寻找Lpp20的HLA限制性表位，而不是在临床试验中测试H-2d限制性表位。在这项研究中，我们利用H.pylori感染者的PBMC鉴定到Lpp20的CD4+T细胞表位。为了系统有效地鉴定免疫优势表位，采用短期体外T细胞扩增的方法提高Lpp20特异性T细胞的比例。这种鉴定方法还需要大量的重叠合成肽，比较昂贵和费时，但最终我们找到合适的CD4+T细胞表位(SEQIDNO.14和SEQIDNO.36)，可靠、准确。更重要的是还能使我们能够评估所鉴定的表位是免疫优势还是亚优势。本专利技术不仅有利于进一步理解抗H.pylori感染的保护性免疫机制，更有助于表位疫苗的设计。然而，H.pylori有大量基因组，编码许多保护性抗原。因此，有必要更好地理解CD4+T细胞反应在其他H.pylori编码抗原的特性和鉴定其他HLA等位基因限制的免疫优势CD4+T细胞表位。附图说明图1Lpp20特异性CD4+T细胞在H.pylori感染者中的反应。分离受试者PBMC，先用0.2μmol/LrLpp20刺激，13天后用Lpp20重叠合成肽库(5μmol/L)刺激，ICS法检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例，DMSO刺激作为对照。(A)H.pylori未感染者N1；(B)H.pylori感染者H1。(C)分离30个H.pylori未感染者(-)和30个H.pylori感染者(+)PBMC，用以上所述方法检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。图2Lpp20的免疫优势CD4+T细胞表位的筛选和鉴定。分离H.pylori感染者PBMC，先用0.2μmol/LrLpp20刺激，13天后再用27个18mer重叠肽(5μmol/L)分别刺激，ICS法检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例，A-F分别代表H.pylori感染者H1、H6、H11、H16、H21和H26。图3免疫优势表位L55-72和L79-96的核心序列的筛选和鉴定。分离H.pylor感者H1和H6的PBMC，先用0.2μmol/LrLpp20刺激，13天后用5μmol/L13mer重叠肽刺激，ICS法检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。(A)利用步移重叠13mer肽对L55-72的核心序列进行筛选。(B)利用步移重叠13mer肽对L79-96的核心序列进行筛选。(C)滴定L55-72，L57-69和L59-71(5×10-9mol/L～5×10-5mol/L)并比较活性。(D)滴定L79-96，L83-95和L85-97(5×10-9mol/L～5×10-5mol/L)并比较活性。图4免疫优势表位L55-72和L79-96HLA限制性的鉴定。分离H.pylori感染者H6和H1的PBMC，体外扩增建立Lpp20的特异性T细胞系，加入抗HLA-DR，HLA-DP或HLA-DQ抗体处理30min，用L57-69或L83-95刺激，ICS法检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。(A)L55-72的HLA限制性分析。(B)L83-95的HLA限制性分析。(C)含有不同HLA分型的一组BLCLs，用作APC，递呈13mer肽。(D)L55-72的HLA-DR亚型分析。(E)L83-95的HLA-DR亚型分析。图5L57-69和L83-95被自体DC自然加工和递呈。(A)L57-69、rLpp20、HP-WCL或BSA刺激DC24h，加入莫能霉素，然后与感染者H6的L57-69特异性T细胞共同培养5h，用ICS测定分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。(B)用同样的方法测定感染者H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫优势肽，其特征在于，其组成如SEQ ID NO.14所示。

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫优势肽，其特征在于，其组成如SEQIDNO.14所示。2.一种幽门螺旋杆菌Lpp20的HLA限制性CD4+T细胞表位免疫核心肽，其特征在于，其组成如SEQIDNO.36所示。3.权利要求1所述免疫优势肽在制备幽...

【专利技术属性】
技术研发人员：李妍，宁云山，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44