西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法，旨在提供一种西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法。本发明专利技术半抗原在保留西地那非基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的西地那非基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别；本发明专利技术通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达12.7，可用于西地那非的免疫检测；其分子结构式：

Sildenafil hapten, artificial antigen and preparation method thereof

The invention discloses a sildenafil hapten, an artificial antigen and a preparation method thereof, aiming at providing a sildenafil hapten, an artificial antigen and a preparation method thereof. The hapten of the invention introduces a connecting arm structure and an active group for coupling macromolecules on the basis of retaining the basic structure of sildenafil, which not only facilitates its coupling with macromolecules, but also fully exposes its molecular structure and the basic structure of sildenafil with small molecular weight after coupling, thus avoiding its masking by macromolecules. The invention couples hapten and protein to prepare artificial antigen by active esterification method, and the coupling ratio can reach 12.7, which can be used for immunoassay of sildenafil.

【技术实现步骤摘要】
西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法
本专利技术公开了一种半抗原、人工抗原，具体涉及一种西地那非半抗原、人工抗原，本专利技术还公开了西地那非半抗原、人工抗原的制备方法。
技术介绍
西地那非(Sildenafil)，即枸橼酸西地那非片，也称万艾可，俗称“伟哥”，分子式：C22H30N6O4S，CAS登录号为139755-83-2，可以有效改善阴茎勃起硬度，用于治疗男性勃起功能障碍(ED，也称阳痿)。该药上市20余年，推动ED治疗取得了革命性的进展。以它为代表的口服药物被美国、欧洲、中国、日本等多个国家和地区的医学指南推荐作为ED的一线治疗。西地那非最常见的副作用是：头痛、面部潮红、胃部不适、视力异常，如视觉色彩改变(如有蓝色色晕)和视力模糊、鼻塞或流鼻涕、背痛、肌肉痛、恶心、头晕、皮疹。也可能引起严重的副作用，包括：1.持续勃起(异常勃起)：如果持续勃起超过4个小时，立即寻求医疗帮助。如不即刻处理，异常勃起能对阴茎产生永久性损害；2.单眼或双眼突然视力丧失：这是一种严重的眼病征兆，称为非动脉性前部缺血性视神经病变(NAION)；3.突发听力减退或听力丧失：某些人可能会出现耳朵嗡嗡响(耳鸣)或头晕。近年来，中成药及保健品非法添加化学物质越来越引起人们的关注，不法药商为了谋取非法利益，通过非法加入西地那非，使疗效缓和的中成药或保健品具有了暂时的速效、高效或特效，增加销量，获取非法高额利润。但作为患者，在长期不知情的情况下服用含有西地那非的中成药或保健品会引起严重的副作用。目前，检测中成药或保健品中是否含有西地那非成分，采用的仍是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行分析，或是使用大型的试验车，这样都很不方便，而且反应时间长，实验耗资较大。免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，具有灵敏、对仪器要求不高、操作简单、成本低等优点。西地那非属于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具备反应性和免疫原性，为了实现西地那非的免疫检测，不仅需要合成具备高效价的西地那非抗原，而且还需要筛选特异性强、敏感度高的西地那非单克隆抗体。但是目前尚没有有关西地那非单克隆抗体的相关报道。对于技术人员来说高效价的西地那非抗原的设计仍是难点。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供了一种西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法。本专利技术半抗原在保留西地那非基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的西地那非基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别；本专利技术通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达12.7，可用于西地那非的免疫检测。为此，本申请提供的第一个技术方案是这样的:一种西地那非半抗原，其分子结构式如式I所示：其中，n为1或2或3，m为1、2或3。本专利技术提供的第二个技术方案是这样的：1)在反应器中，放入溶剂1,4-二氧六环，再加加入质量比为1﹕5～13的西地那非与环形酸酐，在弱碱性、40～50℃密闭条件搅拌反应10～12h，再将反应液倾入水中，用乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，以无水Na2SO4进行干燥，浓缩后得到西地那非衍生物；2)将步骤1)得到的西地那非衍生物与脂肪类二胺按质量比为1：4～10在120～130℃，反应12～14h；将产物减压浓缩至近干，得油状粗产物；加入纯净水，超声分散洗涤后，抽滤收集固体，干燥得到西地那非半抗原。进一步的，上述的西地那非半抗原的方法，所述环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。进一步的，上述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，所述弱碱性条件的pH值为7.5。进一步的，上述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，所述脂肪类二胺为乙二胺、丙二胺或丁二胺。本专利技术提供的第三个技术方案是这样的：一种西地那非人工抗原，其分子结构式如式II所示：其中，n为1、2或3，m为1、2或3。本专利技术提供的第四个技术方案是这样的：一种西地那非人工抗原的制备方法，包括如下步骤：1)将西地那非半抗原与EDC、NHS加入至有机溶剂中，在15～30℃、避光条件下搅拌反应12～14h，得到一号反应液；2)将载体蛋白与磷酸缓冲液混合按照质量比1：1～1.2混合，得到二号反应液；3)在搅拌条件下，将一号反应液按每3-7秒1滴的速度滴入二号反应液，滴加完毕，在15～30℃、避光条件下搅拌反应30～60min，再在3～5℃、避光条件下搅拌反应46～50h，对反应液进行纯化即得；所述二号反应液中的载体蛋白与所述一号反应液中的西地那非半抗原质量比例为：1:15～25进一步的，上述西地那非人工抗原的制备方法，所述有机溶剂为DMF。进一步的，上述西地那非人工抗原的制备方法，所述的纯化是将反应液进行离心处理，并将上清液置于装有pH值为7.0～7.5磷酸盐缓冲液的分子截留为20000～30000的透析袋中，在3～5℃的条件下进行透析46～50小时，每隔6～8小时换一次磷酸盐缓冲液，保留透析袋中所得溶液。进一步的，上述西地那非人工抗原的制备方法，所述的载体蛋白为牛血清蛋白BSA。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下优点：本申请以西地那非为原料，与环形酸酐反应，得到羧基化的西地那非衍生物，并进一步与脂肪类二胺反应合成半抗原；该半抗原在保留西地那非基本结构的基础上引入连接臂(linker)结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量(474.58)较小的西地那非基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。本申请将西地那非半抗原通过活性酯化法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达12.7，可用于西地那非的免疫检测。本申请获得的人工合成抗原可进一步制备抗体，运用到胶体金试纸中，此胶体金试纸可用于食品保健品非法添加西地那非的快速筛查。附图说明图1示试验例1中BSA、西地那非(SI)、偶联物SI-BSA的紫外全波谱扫描图。具体实施方式本专利技术公开了西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的西地那非半抗原、人工抗原及其制备方法的反应机理为：其中n＝1，2，3，m为1、2或3。在本专利技术提供的实施例中，式I所示半抗原的制备方法包括步骤：1)将1份西地那非与5～13份环状酸酐混合后，溶解于30份的1,4-二氧六环中，然后逐滴加入5滴三乙胺(pH为7.5)，40-50℃密闭搅拌反应10-12h。反应结束后，将反应液倾入水中，用100份乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，以无水Na2SO4进行干燥，浓缩后得到固体，75％乙醇重结晶得到固体产物为西地那非衍生物。2)将1份西地那非衍生物与4～10份脂肪类二胺混合，130℃搅拌反应12h，产物减压浓缩至近干，得油状粗产物；加入50份纯净水，超声分散洗涤后，抽滤收集固体，干燥得到西地那非半抗原。在本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种西地那非半抗原，其特征在于，其分子结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种西地那非半抗原，其特征在于，其分子结构式如式I所示：其中，n为1或2或3，m为1、2或3。2.制备权利要求1所述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，1)在反应器中，放入溶剂1,4-二氧六环，再加加入质量比为1﹕5～13的西地那非与环形酸酐，在弱碱性、40～50℃密闭条件搅拌反应10～12h，再将反应液倾入水中，用乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，以无水Na2SO4进行干燥，浓缩后得到西地那非衍生物；2)将步骤1)得到的西地那非衍生物与脂肪类二胺按质量比为1：4～10在120～130℃，反应12～14h；将产物减压浓缩至近干，得油状粗产物；加入纯净水，超声分散洗涤后，抽滤收集固体，干燥得到西地那非半抗原。3.根据权利要求2所述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，所述环形酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐。4.根据权利要求2所述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，所述弱碱性条件的pH值为7.5。5.根据权利要求4所述的西地那非半抗原的方法，其特征在于，所述脂肪类二胺为乙二胺、丙二胺或丁二胺。6.一种西地那非人工抗原，其特征在于，其分子结构式如式II所示：其中，n为1或2或3，m为1、2或3。7.制备权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玄贺，卢宇靖，蔡森源，李莹，龙威，黄宝华，张焜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44