一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法技术

本发明专利技术涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，包括如下步骤：禽蛋样品提取与净化：采用97:2:1，V/V的甲醇:氨水:水溶液为提取剂，加速溶剂萃取ASE技术提取，离心浓缩仪蒸发浓缩，正己烷手动去脂；液相色谱‑串联质谱检测。本发明专利技术选择了甲醇:氨水:超纯水（97:2:1，V/V）作为提取剂，加速溶剂萃取法同时提取禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在禽蛋中添加浓度分别为LOQ、0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL的提取回收率分别大于或等于90.31%、93.40%、92.32%和92.35%，满足兽药残留检测方法的需求。

A method for simultaneous and efficient extraction of polyresidues of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and its metabolite florfenicol amine from poultry eggs

The invention relates to the field of veterinary drug residue detection, in particular to a method for simultaneously and efficiently extracting Multi-residues of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and its metabolite, florfenicol, from poultry eggs, including the following steps: extracting and purifying poultry eggs with 97:2:1, V/V methanol: ammonia water: aqueous solution as extractant, accelerating solvent. Extraction by ASE technology, evaporation and concentration by centrifugal concentrator, manual degreasing by n-hexane, and detection by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The method selects methanol: ammonia water: ultrapure water (97:2:1, V/V) as extractant, and simultaneously extracts polyresidues of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and its metabolite florfenicol amine in poultry eggs by accelerated solvent extraction. Chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and its metabolite, florfenicol, were added to poultry eggs at concentrations of LOQ, 0.5 MRL, 1.0 MRL and 2.0 MRL. The extraction recovery rates were greater than or equal to 90.31%, 93.40%, 92.32% and 92.35% respectively, which met the requirements of veterinary drug residue detection methods.

【技术实现步骤摘要】
一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法
本专利技术涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种用加速溶剂萃取仪从禽蛋中同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法。
技术介绍
在对动物源性食品中的兽药进行检测时，只有将药物从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。纯品氯霉素为中性的白色或微带黄绿色针状、长片状结晶或结晶性粉末，味极苦，性质稳定，熔点为149～15l℃。微溶于水，稍溶于乙二醚，不溶于苯及石油醚，但易溶于甲醇、乙醇、丙二醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂中，在乙醇中的溶解度可达400mg/mL。甲砜霉素为白色结晶性粉末，无臭。在二甲基甲酰胺中易溶，微溶于水，溶于甲醇，几乎不溶于乙醚或氯仿。氟苯尼考为白色或类白色的结晶性粉末，无臭，在二甲基甲酰胺中极易溶解，在甲醇中溶解，在冰醋酸中略溶，在水或氯仿中极微溶解。0.5％水溶液的pH值为4.5～6.5，最大吸收波长为224nm，与甲砜霉素相同。氟苯尼考胺为氟苯尼考在机体内的主要代谢产物。国内外关于动物源性食品中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法主要为液-液萃取法、固相萃取法，一般提取剂为碱性乙酸乙酯和碱性乙酸乙酯-乙腈溶液。但目前为止，采用加速溶剂萃取技术同时提取禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法在国内外尚未见报道。加速溶剂萃取技术具有溶剂用量少、萃取速度快、效率高、回收率高、重现性好和自动化程度高等优势被广泛应用在兽药残留分析领域。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺化学性质稳定适合加速溶剂萃取，同时相比液-液萃取法，可以避免手动萃取带来的误差和重现性差等问题，耗时短，适合批量处理样品。因此，本专利技术采用加速溶剂萃取技术同时高效提取禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺残留。
技术实现思路
为了解决提取禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺回收率低的问题,本专利技术提供一种用加速溶剂萃取仪从禽蛋中同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，可以避免手动萃取带来的误差和重现性差等问题，耗时短，适合批量处理样品。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)禽蛋样品提取与净化：采用97:2:1，V/V的甲醇:氨水:水溶液为提取剂，加速溶剂萃取ASE技术提取，离心浓缩仪蒸发浓缩，正己烷手动去脂；具体地，步骤(1)的具体过程为：准确称取均质好的禽蛋空白样品放于研钵中，并加入硅藻土研磨，装入萃取池中，用ASE进行萃取；在1500psi，80℃萃取条件下，每个萃取池用甲醇:氨水:水溶液以97:2:1，V/V的比例静态萃取1次，静态萃取时间5min，氮气吹扫60s，收集萃取液待用；将上述萃取收集的萃取液转移至离心管，蒸发浓缩；萃取液蒸发浓缩后，加入纯乙腈，漩涡振荡混匀，加入正己烷漩涡混匀，去脂，静置，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于氮吹仪上吹干，待用；2)液相色谱-串联质谱检测。液相色谱-串联质谱检测的步骤中，a.液相色谱条件色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18；流动相：A相为2mM乙酸铵-水溶液，B相为2mM乙酸铵-乙腈溶液；流速：0.2mL/min；设置特定的梯度洗脱程序；b.质谱条件离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描FFA和负离子扫描CAP、TAP、FF和d5-CAP；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾离子化电压IS：5000～5500V正离子扫描、4000～4500V负离子扫描；离子源温度TEM：450～500℃；离子源喷雾气Gas1:40～45psi正离子扫描、45～50psi负离子扫描；辅助加热气Gas2：45～50psi正离子扫描、35～40psi负离子扫描；气帘气CUR：12～15psi正离子扫描、16～20psi负离子扫描；碰撞气CAD：6～8psi；碰撞室出口电压CXP：5～6V正离子扫描、7～8V负离子扫描；射入电压EP：6.5～7.5V正离子扫描、11～13V负离子扫描；每个定量离子对驻留时间：100.0ms，每个定性离子对驻留时间：100.0ms。在b.质谱条件中，CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的保留时间和其它质谱参数如下：注：*定量离子对。在a.液相色谱条件中，所述特定的梯度洗脱程序如下：分离禽蛋中CAP、TAP、FF、FFA和d5-CAP的梯度洗脱程序在a.液相色谱条件中，色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18，2.1×50mm，1.7μm；保护柱：WatersVanGuardTMBEHC18，1.7μm。在a.液相色谱条件中，进样体积：10μL；柱温25～30℃。更具体地，步骤(1)为：准确称取5.0±0.05g均质好的禽蛋空白样品放于研钵中，并加入4.0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒，装入22mL的萃取池中，在1500psi，80℃条件下用ASE萃取，每个萃取池用甲醇:氨水:水溶液(97:2:1，V/V)静态萃取1次，静态萃取时间5min，氮气吹扫60s，收集萃取液待用；收集的萃取液转移至50mL离心管，置于50℃离心浓缩仪(2000×g)上蒸发浓缩至1～2ml；萃取液蒸发浓缩后，加入1ml纯乙腈，漩涡振荡混匀1min，加入10mL正己烷(用纯乙腈饱和)漩涡混匀，去脂，静置5min，弃去上层正己烷，下层提取液重复提取一次，然后置于50℃氮吹仪上吹干；将氮吹后的样品用5.0mL55％乙腈分两次漩涡振荡溶解，12100×g离心15min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供UPLC-MS/MS检测。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术比较了不同提取剂(乙酸乙酯:乙腈:氨水(49:49:2，V/V)、乙酸乙酯：氨水(97:3，V/V)、甲醇:水(97:3，V/V)和甲醇:氨水:超纯水(97:2:1，V/V))、不同提取方法(液-液萃取法和加速溶剂萃取法)对提取回收率的影响，最终选择了甲醇:氨水:超纯水(97:2:1，V/V)作为提取剂，加速溶剂萃取法同时提取禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在禽蛋中添加浓度分别为LOQ、0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL的提取回收率分别大于或等于90.31％、93.40％、92.32％和92.35％，满足兽药残留检测方法的需求。回收率详见表3～7。本研究结果可为禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺残留检测标准的制定提供科学依据，同时为监控禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺残留提供技术支撑。附图说明图1氯霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；图2甲砜霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；图3氟苯尼考标准品(50ng/mL)二级质谱图；图4氟苯尼考胺标准品(50ng/mL)二级质谱图；图5d5-氯霉素标准品(50ng/mL)二级质谱图；图6空白鸡蛋样品(a)和空白鸡蛋样品添加标准品(b)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)禽蛋样品提取与净化：采用97:2:1，V/V的甲醇:氨水:水溶液为提取剂，加速溶剂萃取ASE技术提取，离心浓缩仪蒸发浓缩，正己烷手动去脂；2)液相色谱‑串联质谱检测。

【技术特征摘要】
1.一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)禽蛋样品提取与净化：采用97:2:1，V/V的甲醇:氨水:水溶液为提取剂，加速溶剂萃取ASE技术提取，离心浓缩仪蒸发浓缩，正己烷手动去脂；2)液相色谱-串联质谱检测。2.根据权利要求1所述的一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺多残留的方法，其特征在于，液相色谱-串联质谱检测的步骤中，a.液相色谱条件色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18；流动相：A相为2mM乙酸铵-水溶液，B相为2mM乙酸铵-乙腈溶液；流速：0.2mL/min；设置特定的梯度洗脱程序；b.质谱条件离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子扫描FFA和负离子扫描CAP、TAP、FF和d5-CAP；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾离子化电压IS：5000～5500V正离子扫描、4000～4500V负离子扫描；离子源温度TEM：450～500℃；离子源喷雾气Gas1:40～45psi正离子扫描、45～50psi负离子扫描；辅助加热气Gas2：45～50psi正离子扫描、35～40psi负离子扫描；气帘气CUR：12～15psi正离子扫描、16～20psi负离子扫描；碰撞气CAD：6～8psi；碰撞室出口电压CXP：5～6V正离子扫描、7～8V负离子扫描；射入电压EP：6.5～7.5V正离子扫描、11～13V负离子扫描；每个定量离子对驻留时间：100.0ms，每个定性离子对驻留时间：100.0ms。3.根据权利要求2所述的一种从禽蛋同时高效提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢恺舟，王波，赵霞，谢星，庞茂达，王雅娟，郭亚文，卜晓娜，刘楚君，张跟喜，张涛，戴国俊，王冉，卜仕金，刘学忠，王金玉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32