甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1制造技术

本发明专利技术公开一种甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1。所述WRKY转录因子基因SsWRKY1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该基因直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程，是与抗旱直接相关的基因。本发明专利技术为深入研究该基因在甘蔗细茎野生种中的抗旱机制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及干旱胁迫下的甘蔗细茎野生种WRKY转录因子基因，并基于该基因的序列设计引物，通过实时荧光定量PCR检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫下差异表达的方法。
技术介绍
甘蔗在生长发育过程中，会遭遇到低温、干旱等逆境胁迫，严重制约了甘蔗的生长、糖分及生物产量。因此，如何提高甘蔗对逆境胁迫的抗性、培育抗逆性强的新品种，已经成为甘蔗遗传育种研究的重要课题。甘蔗细茎野生种(SaccharumspontaneumL.)，又称割手密，是甘蔗属中分布最广的一个种，特点是纤维多，蔗汁少，空心，糖分低，优点是早熟、早花、易花，生势好，宿根性好，根群发达，有地下茎，早生快发，耐旱、耐瘠，抗逆性强，抗病虫害的能力强。(黄忠兴,周峰,王勤南,等.国内外割手密资源农艺性状表型遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2012,13(5):825-829；许文花,杨清辉.甘蔗割手密无性系抗旱性鉴定[J].亚热带农业研究,2005,1(1):22-26；徐建云,陈超君,钟健,等.甘蔗育种、引种新理念的探讨[J].广西蔗糖,2005(2):3-7.)，因此，通过发掘甘蔗细茎野生种中的抗旱新基因，并从中克隆分离抗旱相关基因，对甘蔗抗旱育种具有重要意义。WRKY转录因子(WRKYtranscriptionfactor)是植物所特有的最大的转录因子家族之一，是一类DNA结合蛋白，参与植物的各个生理过程，涉及生长，发育和自我应激信号传导或与不同的基因和转录因子交叉调节。WRKY转录因子包含的WRKY结构域，是具有60个氨基酸长的DNA结合结构域，特征在于N端具有一个高度保守的WRKYGQK核心基序和CX4-5CX22-23HXH锌指结构(IshiguroS,NakamuraK.CharacterizationofacDNAencodinganovelDNA-bindingprotein,SPF1,thatrecognizesSP8sequencesinthe5’upstreamregionsofgenescodingforsporaminandbetaamylasefromsweetpotato[J].MolecularGeneticsandGenomics,1994,244(6)：563-571；Rushton,PaulJ,Somssich,etal.WRKYtranscriptionfactors[J].TrendsinPlantScience,2010,15(5)：247-258)。在高温、冷害、干旱等非生物胁迫在一定程度上会诱导WRKY转录因子表达上调或下调并引发信号级联网络，以提高植物的胁迫耐受性(JoshiR,WaniSH,SinghB,etal.Transcriptionfactorsandplantsresponsetodroughtstress：currentunderstandingandfuturedirections[J].FrontiersinPlantScience,2016,7：1029；RushtonDL,TripathiP,RabaraRC,etal.WRKYtranscriptionfactors：Keycomponentsinabscisicacidsignalling[J].PlantBiotechnolJ,2012,10(1)：2-11.)。但是，在甘蔗细茎野生种中尚无克隆到编码WRKY转录因子的基因及其受到干旱环境胁迫时功能的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为了提高现有栽培甘蔗品种的抗旱性，提高甘蔗的生物产量，并为进一步扩大甘蔗种植区域(由水肥条件好的地区转移至干旱贫瘠地区)，提供一个新的甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，还提供一对扩增该基因的引物，以及一种检测该基因在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫差异表达的方法，从而进一步为甘蔗抗旱性育种奠定基础并提供候选基因。本研究从受干旱胁迫的甘蔗细茎野生种中利用RT-PCR技术克隆获得一个编码WRKY转录因子的基因，在NCBI中经BLASTn比对分析，与高粱WRKY基因的同源性为83％，具有WRKY特有的WRKYGQK7肽和CX4-5CX22-23HXH锌指结构，推测该基因编码WRKY转录因子，故将该基因命名为WRKY转录因子基因SsWRKY1。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：1.甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.扩增技术方案1所述的甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物，由上游引物WP-F和下游引物WP-R组成，所述上游引物WP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物WP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测技术方案1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，包括(1)干旱处理，(2)总RNA的提取，(3)cDNA第一链的合成，(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，其特征在于：在所述的(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，使用的引物为引物WQF和引物WQR：所述引物WQF的碱基序列如SEQIDNO：4所示，引物WQR的碱基序列如SEQIDNO：5所示。4.根据技术方案3所述的一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：在所述的(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，PCR反应体系为：总体积25μl，其中，2×SuperRealPreMixPlus10μl，10μM引物WQF0.6μl，10μM引物WQR0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROXReferenceDye0.6μl，RNase-freeddH2O12.2μl；PCR反应程序为：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。5.根据技术方案3所述的一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：在所述的(1)干旱处理中：供试的甘蔗细茎野生种分为实验组和对照组，对照组按常规管理浇水；实验组分为3个处理，处理1：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续2d不浇水；处理2：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续4d不浇水；处理3：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续6d不浇水。本专利技术首次提出了甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1。通过实时荧光定量PCR检测了WRKY转录因子基因SsWRKY1在不同干旱胁迫时间下的甘蔗细茎野生种叶片中的3个时期的差异表达情况，发现WRKY转录因子基因S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.扩增权利要求1所述的甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物，由上游引物WP-F和下游引物WP-R组成，所述上游引物WP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物WP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，包括(1)干旱处理，(2)总RNA的提取，(3)cDNA第一链的合成，(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，其特征在于：在所述的(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，使用的引物为引物WQF和引物WQR：所述引物WQF的碱基序列如SEQIDNO：4所示，引物WQR的碱基序列如SEQIDNO：5所示。4.根据权利要求3所述的一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富生，何丽莲，徐荣，吴清莲，孟玉，曹哲群，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53