一种马尾松花粉的超低温保存方法技术

本发明专利技术公开了一种马尾松花粉的超低温保存方法，其包括花穗棒的采集、花粉收集、花粉干燥、花粉冻存、花粉化冻、花粉离体萌发等步骤。该方法针对马尾松花粉特性对超低温花粉保存方法进行优化，方法简便，操作简单，提高马尾松花粉的保存期限和保存寿命，提升马尾松花粉利用率，解决马尾松花期不遇等杂交制种问题。

A cryopreservation method for Masson Pine Pollen

The invention discloses an ultra-low temperature preservation method of Masson Pine pollen, which comprises the steps of collecting spike sticks, collecting pollen, drying pollen, freezing pollen, thawing pollen, in vitro germination of pollen, etc. According to the characteristics of Pinus massoniana pollen, the method of ultra-low temperature pollen preservation was optimized. The method was simple and easy to operate. The preservation period and life span of Pinus massoniana pollen were increased, the utilization rate of Pinus massoniana pollen was increased, and the problems of hybrid seed production such as the unexpected flowering period of Pinus massoniana were solved.

【技术实现步骤摘要】
一种马尾松花粉的超低温保存方法
本专利技术涉及林木种质资源超低温保存方法，具体涉及一种马尾松花粉的超低温保存方法。
技术介绍
马尾松（PinusmassonianaLamb）为松科松属常绿高大乔木，是我国特产的主要乡土树种，也是南方亚热带地区分布最广，资源最多的森林群落，具有生长快、材质优、适应性强、综合利用率高等特点，在森林资源建设和生态发展中占及其重要的地位。由于马尾松分布量大面广、遗传变异丰富而良莠不齐,对其种质资源进行保存具有重要的意义。花粉是植物种质的形式之一，包含该物种的所有基因类型，遗传信息极其丰富，是种质保存、交换、人工辅助授粉以及杂交育种的重要材料。有研究表明，在自然状态下，马尾松花粉的寿命只有1个月，这给种质研究以及杂交育种工作带来极大的不便，因此开展花粉的中长期保存就显得尤为重要。超低温保存被誉为是种质资源长期保存最有效的方法，可以保存茎尖、愈伤组织、休眠芽、花粉、细胞、原生质体等。在超低温状态下，材料新陈代谢几乎完全停止，只要方法合适，液氮充足，理论上可以无限期保存材料。目前多个本木植物如柚子、油棕、柳树、山茶、桂花等都成功开展了花粉的超低温保存研究。研究表明不同植物花粉其超低温保存所采用的方法以及保存参数会因植物自身特性不同而不同，因此亟需提供一种针对马尾松种质花粉的超低温保存方法，以帮助延长花粉寿命，维持马尾松种质资源的遗传多样性及种子园人工辅助授粉、解决杂交育种中花期不遇、有效加快育种速度，提高育种效率，避免病虫害的侵入；同时便于种质交换，为花粉培养的细胞工程和基因工程以及花粉的生理生化研究随时提供稳定的试验材料。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术提供了一种马尾松花粉的超低温保存方法，该方法针对马尾松花粉特性对超低温花粉保存方法的花粉采集、花粉干燥、花粉冻存、花粉化冻、花粉离体萌发等个步骤进行优化，提高马尾松花粉的保存期限和保存寿命，提升马尾松花粉利用率，解决花期不遇等杂交制种问题。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种马尾松花粉的超低温保存方法，其包括如下步骤：（1）花穗棒的采集：待马尾松雄球花小孢子叶球微微发黄至散粉期间，选择晴天上午，采集花穗棒，用剪刀剪取其花穗棒，用牛皮纸包好，带回实验室；（2）花粉收集：将花穗棒放到250ml锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱内匀速震荡24-48h；待花粉散开后，将花粉收集到硫酸纸上，每隔12h收集一次；（3）花粉干燥：将收集到的花粉置于装有硅胶的干燥器中干燥至其含水量为9-11%；（4）花粉冻存：花粉冻存方法为以下方法中的一种：①将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，直接投入液氮中保存；②将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；③将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，再在-20℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；（5）花粉化冻：将冷冻管从液氮中取出化冻；（6）花粉离体萌发：首先在载玻片上等距离加入3滴用于花粉离体萌发的半固体培养基，每滴50ul，然后用吸管蘸取少量花粉轻轻喷于半固体培养基上，将载玻片放入装有湿润滤纸的培养皿中，培养皿用封口膜封好，28℃黑暗培养36h。进一步优化，上述步骤（2）花粉收集的方法，具体是将花穗棒放到烘干的250ml锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱内培养，以120rpm匀速震荡24-48h，期间保持27℃恒温及2000lux光照；待花粉散开后，向下倾斜锥形瓶45°-90°，用手掌拍打锥形瓶底部，将花粉收集到硫酸纸上，每隔12h收集一次。进一步优化，上述步骤（5）化冻的方法可以是将冷冻管从液氮中取出，打开包有花粉的铝箔纸使之暴露于空气中，室温化冻30min；或者将冷冻管从液氮中取出，在38℃水浴化冻1.5min后，打开包有花粉的铝箔纸使之暴露于空气中，室温化冻30min；或者将冷冻管从液氮中取出，流水化冻30min。进一步优化，上述步骤（6）中的半固体培养基是由蔗糖50-200mg/ml，硼酸0.1-10mg/ml，复合氨基酸螯合钙0.3-3mg/ml，PEG600010-150mg/ml,琼脂3-6mg/ml溶于蒸馏水，并定容至100ml，经过常规高压灭菌制备得到；所述复合氨基酸螯合钙是由多种氨基酸与无机钙盐通过化学合成反应而生产的一种有机钙类物质。本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：1、本专利技术在花粉收集步骤中，结合恒温、光照、震荡培养，极大的提高了花穗散粉效率，缩短了花粉的收集时间；同时2000lux光照和27℃恒温培养可以保证花粉干燥不易发霉结块；另外，利用锥形瓶下宽上窄的特征，45°-90°向下倾斜只需用小镊子或小药匙在瓶口稍加阻挡就能轻松将花粉倒出，而将花穗棒留在瓶里。2、本专利技术在花粉干燥步骤中，严格控制花粉含水量，避免马尾松花粉细胞中水分在冷冻时结晶使细胞受损，提高花粉存活率。3、本专利技术在花粉冻存步骤中，先是将干燥后的花粉用铝箔纸包装，可以将花粉有效隔绝避免污染，同时保证花粉同质降温，减少异质冰晶的形成；冻存方法选择进行预冻处理是分不同的温度阶段降温后，再投入液氮中保存，可以对马尾松花粉进行有效的冷冻锻炼，提高花粉存活率；由本专利技术的实验数据可以看出，马尾松花粉在9-11%含水量条件下不需要冷冻锻炼，可直接投入液氮进行保存，也能获得良好的花粉存活率。4、本专利技术在花粉化冻步骤中提供3种化冻方法，特别是先水浴化冻然后再室温化冻的分阶段化冻方法，第一阶段可以快速通过再次结冰的危险温度区（-10℃到-50℃），避免化冻时细胞内发生次生结冰；第二阶段在室温下吸收空气中的水分进行复水，避免化冻或花粉萌发过程中吸水造成的渗透冲击破坏细胞膜体系，提高花粉存活率。5、本专利技术研发了特殊的花粉冻后离体萌发半固体培养基，将蔗糖50-200mg/ml，硼酸0.1-10mg/ml，复合氨基酸螯合钙0.3-3mg/ml，PEG600010-150mg/ml,琼脂3-6mg/ml溶于蒸馏水，并定容至100ml，经过常规高压灭菌得到，该培养基满足了马尾松花粉萌发所需的营养物质，其中所使用的培养基中添加复合氨基酸螯合钙成分不仅为马尾松花粉萌发所需提供钙元素，其氨基酸成分也可以促进马尾松花粉的萌发；PEG6000和硼酸也有效促进了花粉的萌发效率。6、本专利技术在离体培养阶段在载玻片上等距离加入3滴半固体培养基，不加盖玻片，因为半固体培养基粘稠不易流动，便于观察，可以在一个玻片上做3个重复，节省载玻片和盖玻片，同时又具有较好的透气性和萌发率。7、采用本方法保存的花粉与收集后的新鲜花粉在同样条件下离体萌发的萌发率相差不大，且分别取超低温保存1、2、3、4个月的花粉进行离体萌发检测并未见萌发率有明显下降，由此可见本方法适合马尾松种质特性，可以有效提高马尾松花粉的保存期限和保存寿命，提升马尾松花粉利用率，而且方法简便，操作简单。具体实施方式以下通过实施例进一步说明本专利技术，但不作为对本专利技术的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：一种马尾松花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：（1）花穗棒的采集：于2018年3月1-5日，采集广西南宁马尾松花粉，待马尾松雄球花小孢子叶球微微发黄至散粉期本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马尾松花粉的超低温保存方法，其特征在于：其包括如下步骤：（1）花穗棒的采集：待马尾松雄球花小孢子叶球微微发黄至散粉期间，选择晴天上午，采集花穗棒，用剪刀剪取其花穗棒，用牛皮纸包好，带回实验室；（2）花粉收集：将花穗棒放到250ml锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱内匀速震荡24‑48h；待花粉散开后，将花粉收集到硫酸纸上，每隔12h收集一次；（3）花粉干燥：将收集到的花粉置于装有硅胶的干燥器中干燥至其含水量为9‑11%；（4）花粉冻存：花粉冻存方法为以下方法中的一种：将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，直接投入液氮中保存；将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，再在‑20℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；（5）花粉化冻：将冷冻管从液氮中取出化冻；（6）花粉离体萌发：首先在载玻片上等距离加入3滴用于花粉离体萌发的半固体培养基，每滴50ul，然后用吸管蘸取少量花粉轻轻喷于半固体培养基上，将载玻片放入装有湿润滤纸的培养皿中，培养皿用封口膜封好，28℃黑暗培养36h。...

【技术特征摘要】
1.一种马尾松花粉的超低温保存方法，其特征在于：其包括如下步骤：（1）花穗棒的采集：待马尾松雄球花小孢子叶球微微发黄至散粉期间，选择晴天上午，采集花穗棒，用剪刀剪取其花穗棒，用牛皮纸包好，带回实验室；（2）花粉收集：将花穗棒放到250ml锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱内匀速震荡24-48h；待花粉散开后，将花粉收集到硫酸纸上，每隔12h收集一次；（3）花粉干燥：将收集到的花粉置于装有硅胶的干燥器中干燥至其含水量为9-11%；（4）花粉冻存：花粉冻存方法为以下方法中的一种：将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，直接投入液氮中保存；将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；将干燥后的花粉用铝箔纸包好装入2ml冷冻管后，先在4℃温度下保存一周，再在-20℃温度下保存一周，然后投入液氮中保存；（5）花粉化冻：将冷冻管从液氮中取出化冻；（6）花粉离体萌发：首先在载玻片上等距离加入3滴用于花粉离体萌发的半固体培养基，每滴50ul，然后用吸管蘸取少量花粉轻轻喷于半固体培养基上，将载玻片放入装有湿润滤纸的培养皿中，培养皿用封口膜封好，28℃黑暗培养36h...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓宁，陈博雯，张烨，覃子海，肖玉菲，姚瑞玲，刘海龙，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45