一种碱基编辑工具及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种碱基编辑工具及其应用。所述的碱基编辑工具，其特征在于，包括：多拷贝的GCN4与D10A‑Cas9连接形成的GCN4‑D10A；胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv‑APOBEC‑UGI载体或胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI以及防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv‑APOBEC‑UGI‑GB1载体。以及靶向特异位点的sgRNA。本发明专利技术相较于普遍使用的碱基编辑工具，显著地增加了碱基编辑的窗口，进而扩大了碱基编辑在基因组的应用范围。

A base editing tool and its application

The invention provides a base editing tool and its application. The base editing tool is characterized in that the GCN4 D10A formed by linking multiple copies of GCN4 with D10A Cas9, and the scFv APOBEC UGI formed by linking cytosine deaminase APOBEC and uracil glycosylase inhibitor UGI to scFv or cytosine deaminase APOBEC and uracil glycosylase inhibitor UGI are used to And to prevent the thermal stability domain GB1 from being attached to scFv to form the scFv_APOBEC_UGI_GB1 carrier. And targeted sgRNA. Compared with the commonly used base editing tool, the invention significantly increases the window of base editing, thereby expanding the application scope of base editing in genome.

【技术实现步骤摘要】
一种碱基编辑工具及其应用
本专利技术涉及一种新型碱基编辑工具，属于基因编辑领域，更具体地说涉及基于CRISPR系统与碱基脱氨酶结合进行特异性碱基替换的工具。
技术介绍
基因编辑是通过在DNA上特定位点引入序列改变，达到基因的敲除或者外源DNA片段插入的技术手段。目前可编程的核酸酶主要包括三种，早期的锌指核糖核酸酶(ZFN)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)系统和现在普遍使用的CRISPR-Cas9系统1。CRISPR-Cas9基因编辑系统操作简单，仅需改变sgRNA的靶向序列就能在新的靶向位点上进行基因编辑，因此被迅速广泛应用于基因功能研究，细胞或动物水平的疾病造模以及基因治疗2-7。在基因编辑过程中，尽管CRISPR-Cas9能基于同源重组(HDR)机制在供体模板DNA的介导下引入碱基突变或者片段的插入，进而获得感兴趣的突变或者达到基因修复的目的。但CRISPR-Cas9也会通过非同源末端连接(NHEJ)引入不可控的插入或缺失突变(indels)。两种修复机制之间的竞争也导致同源重组效率不高。为了提高碱基突变的效率，一种通过将胞嘧啶脱氨酶融合在dCas9蛋白上，在不引起双链断裂的情况下高效的获得碱基定点突变的工具被研发出来。这种新型工具被称为碱基编辑工具8-12。尽管碱基编辑技术近年才出现，但已经被广泛用于许多领域。比如利用BE3系统以碱基编辑方式成功修复了与乳腺癌相关基因TP53上的一个碱基突变，以及与阿兹海默症相关基因APOE4上的一个碱基突变8。碱基编辑工具在农作物中也具有碱基编辑效率，提供了一种新的育种策略13-15。由于碱基编辑工具能引起定点的突变，在sgRNA库的靶向作用下通过对内源基因主要结构或功能位点进行饱和突变，选取合适的筛选条件，可得到定向进化的蛋白。由于蛋白进化是在胞内进行，将碱基编辑工具用于蛋白进化操作更方便，真正筛选出特定功能的蛋白10，16。碱基编辑工具还能在不引起DNA双链断裂的情况下敲除基因，通过碱基编辑C-to-T使密码子CAG，CGA，CAA和TGG突变为终止密码子TAG，TGA和TAA，导致翻译提前终止达到基因敲除的目的。这种策略被称为iSTOP，这些可被突变成终止密码子的密码子被称为iSTOP-codon。由于不导致DNA双链断裂，利用iSTOP策略做基因敲除能避免在高拷贝位点产生过多DNA双链断裂(DSB)进而引起细胞死亡17，18。基于CRISPR-Cas9的碱基编辑工具扩展了CRISPR-Cas9在基因编辑的应用范围。但现有的碱基编辑工具，普遍存在由于编辑窗口小及PAM序列的限制无法对更多的感兴趣的位点进行编辑。虽然通过改造SpCas9识别不同的PAM可提高覆盖范围，但相较野生型SpCas9对PAM序列NGG的特异性识别，改造版本的SpCas9-BE3对其他PAM的识别效率仍然较低，导致在这些位点的编辑效率不够高效。SunTag系统是一种信号放大系统，最早用于活细胞成像领域。通过在dCas9羧基端融合10份拷贝GCN4抗原表位，招募scFv-GFP到靶向位点，极大放大了靶向位点的荧光信号，成像具有较高的信噪比19。基于SunTag系统的转录激活工具SPH将scFv-GFP替换为scFv-P65-HSF，通过靶向基因的启动子区激活基因表达20。另一种基于SunTag的表观遗传工具scFv-TET1通过在调控元件上主动去甲基化上调基因表达21。本专利技术利用SunTag系统的信号放大策略研发出新型碱基编辑工具BE-PLUS，通过招募10个拷贝的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI到靶向位点来对特定位点进行碱基编辑。BE-PLUS保持高效的碱基编辑效率同时又扩大碱基编辑窗口，提高了碱基编辑的准确性。参考文献1Kim，H.&Kim，J.S.Aguidetogenomeengineeringwithprogrammablenucleases.NatRevGenet15，321-334，doi：10.1038/nrg3686(2014).2Cho，S.W.，Kim，S.，Kim，J.M.&Kim，J.S.TargetedgenomeengineeringinhumancellswiththeCas9RNA-guidedendonuclease.NatBiotechnol31，230-232，doi：10.1038/nbt.2507(2013).3Cong，L.etal.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339，819-823，doi：10.1126/science.1231143(2013).4Hwang，W.Y.etal.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem.NatBiotechnol31，227-229，doi：10.1038/nbt.2501(2013).5Jiang，W.，Bikard，D.，Cox，D.，Zhang，F.&Marraffini，L.A.RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatBiotechnol31，233-239，doi：10.1038/nbt.2508(2013).6Mali，P.etal.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science339，823-826，doi：10.1126/science.1232033(2013).7Jinek，M.etal.RNA-programmedgenomeeditinginhumancells.eLife2，e00471，doi：10.7554/eLife.00471(2013).8Komor，A.C.，Kim，Y.B.，Packer，M.S.，Zuris，J.A.&Liu，D.R.ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble-strandedDNAcleavage.Nature533，420-424，doi：10.1038/nature17946(2016).9Nishida，K.etal.Targetednucleotideeditingusinghybridprokaryoticandvertebrateadaptiveimmunesystems.Science353，doi：10.1126/science.aaf8729(2016).10Hess，G.T.etal.DirectedevolutionusingdCas9-targetedsomatichypermutationinmammaliancells.NatMethods13，1036-1042，doi：10.1038/nmeth.4038(2016).11Chadwick，A.C.，Wang，X.&Musunuru，K.InVivoBaseEditingofPCSK9(ProproteinConvertas本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱基编辑工具，其特征在于，包括：多拷贝的GCN4与D10A‑Cas9连接形成的GCN4‑D10A载体；胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv‑APOBEC‑UGI载体或胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI以及防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv‑APOBEC‑UGI‑GB1载体。

【技术特征摘要】
1.一种碱基编辑工具，其特征在于，包括：多拷贝的GCN4与D10A-Cas9连接形成的GCN4-D10A载体；胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI载体或胞嘧啶脱氨酶APOBEC和尿嘧啶糖基化酶抑制物UGI以及防止多聚化的热稳定性结构域GB1连于单链抗体scFv形成的scFv-APOBEC-UGI-GB1载体。2.如权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于，所述的碱基编辑工具还包括sgRNA载体。3.如权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于，所述的碱基编辑工具还包括靶向特异位点的sgRNA。4.如权利要求1所述的碱基编辑工具，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯松杰，江雯，黄行许，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31