重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用。本发明专利技术将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达后经变性、纯化、复性和交联，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白。该重组蛋白与质量分数为0.4％的壳聚糖溶液充分混合制备成佐剂，再与灭活后的PEDV混合，制得PEDV灭活疫苗。该佐剂在口服免疫小鼠后不但能明显提升灭活PEDV疫苗的局部黏膜免疫效果，还能在血清中加强其全身性免疫效果，该疫苗对实验动物没有致病性，且免疫动物后，在血清及肠组织产生的猪流行性腹泻病毒抗体速度快、水平高且持续时间长。

Recombinant cholera toxin B subunit protein and PEDV inactivated vaccine and its preparation and Application

The invention relates to a recombinant protein, in particular to a recombinant cholera toxin B subunit protein, a PEDV inactivated vaccine, and preparation and application thereof. The recombinant cholera toxin B subunit protein is obtained by denaturing, purifying, renaturing and crosslinking the strain expressing the recombinant cholera toxin B subunit protein after induction and expression. The recombinant protein was fully mixed with 0.4% chitosan solution to prepare adjuvant, and then mixed with inactivated PEDV to prepare inactivated PEDV vaccine. The adjuvant can not only significantly enhance the local mucosal immune effect of inactivated PEDV vaccine after oral immunization, but also enhance the systemic immunity effect in serum. The vaccine has no pathogenicity to the experimental animals, and the antibody against porcine epidemic diarrhea * virus produced in the serum and intestinal tissues is fast and high after immunization. It lasts for a long time.

【技术实现步骤摘要】
重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用
本专利技术涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组霍乱毒素B亚基蛋白、PEDV灭活疫苗及制备与应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)是猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)的主要病原，主要造成猪肠道接触性传染病，其特征为呕吐、腹泻和脱水等。PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一种单股正链具有感染性的RNA病毒，只有一个血清型。1971年首次在英国育肥猪猪场发现，对4～5周龄断奶前仔猪影响较大。随后，欧洲及亚洲多国也开始流行。2013年北美开始爆发，PEDV成为全球流行的病毒并且严重损害了全球养殖业。对于PEDV的防控，除了做好生物防控外，目前疫苗的接种是防控PEDV感染的主要手段。目前商品化的疫苗主要是以全病毒灭活苗和弱毒疫苗为主，但对目前流行毒株的保护效果不是很理想，究其原因可能如下：灭活疫苗肌注后不能够产生有效的黏膜免疫，弱毒疫苗致弱后在肠道稳定性和增殖能力降低，产生的保护力有限。对于PEDV疫苗效力的研究发现，控制PEDV最佳的手段是在仔猪胃肠道内产生大量的黏膜分泌性免疫球蛋白A(secretoryimmunoglobulinA，sIgA)抗体，但目前的灭活疫苗均采用注射的方式，无法有效地激活黏膜免疫去提升sIgA水平。此外，有些养殖场还通过反饲的手段进行防控，虽然在一定的程度上具有保护效果，但也同时存在其他病毒感染的风险，因此不建议过多采用该方法。对于新生仔猪来说，出生后并还不具备成熟的胃肠道免疫系统，因此目前较好地免疫方式是通过免疫分娩前的母猪，通过母猪体内的免疫转化，使仔猪从初乳中获得保护力。虽然目前对PEDV疫苗的研发依然是研究热点，但新型疫苗一直受到成本和批量生产的制约，所以提高传统疫苗的黏膜免疫效果是目前开发PEDV疫苗的关键。霍乱弧菌的霍乱毒素(choleraeenterotoxin，CT)是目前是研究较为热门的黏膜佐剂，同时也是良好的免疫刺激剂，其中CT的B亚单位(CTB)可识别肠黏膜上皮细胞膜的受体神经节苷脂GM1，并与之结合形成复合物，并且本身不具有毒性。因此利用CTB的特性，已有许多研究发现其与病毒关键的结构蛋白融合表达使用，或与关键蛋白在表达后混合使用，二者均有明显的增强免疫效果，目前，CTB已经被广泛地应用于黏膜疫苗的研究，通过滴鼻、皮下以及肌肉注射方式，均可以增强抗原特异性的黏膜免疫反应。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，具有产量高、生长速度快、操作简单、成本低的优点，但大肠杆菌的表达的蛋白中的杂蛋白较多，仍需进一步纯化来获得目的蛋白，纯化流程较复杂。目前蛋白质的纯化主要依据相关蛋白质的理化及生物学性质不同将其与杂蛋白区分开来，无论是产生在上清的可溶性蛋白还是处于沉淀的包涵体蛋白，均能通过有效的手段将所需的目的蛋白纯化出来。纯化后的CTB蛋白利用壳聚糖/TPP离子交联法制备处理，处理后的CTB蛋白与各种佐剂配合使用从而有效提升PEDV传统疫苗的免疫效果。
技术实现思路
为了克服现有技术PEDV传统灭活疫苗黏膜免疫效果差，免疫途径单一等缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述方法制备得到的重组霍乱毒素B亚基蛋白，该蛋白可有效提升灭活PEDV的免疫效果和改良免疫途径。本专利技术的再一目的在于提供上述重组霍乱毒素B亚基蛋白的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种PEDV灭活疫苗。本专利技术的第五个目的在于提供上述PEDV灭活疫苗的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，包含如下步骤：(1)表达：将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达，然后将菌体破碎，分离，收集破碎后的菌体；(2)变性：步骤(1)收集的破碎后的菌体洗涤后加入变性液，超声至澄清，然后30～40℃变性处理1.5～2.5h；离心，收集上清，过滤除杂，得到清液；(3)纯化：将步骤(2)制得的清液采用镍柱纯化，得到重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(4)复性：将步骤(3)中制得的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白依次在8M、6M、4M、2M和0M尿素溶液中透析，得到复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(5)交联：冰浴条件下，将壳聚糖/醋酸溶液与步骤(4)制得的复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白混合均匀，调整体系pH值为5.3～5.8；然后20～40℃搅拌处理5～15min，随后边搅拌边缓慢滴加三聚磷酸钠(TPP)溶液，其中，交联剂三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比1:5；滴加完成后继续搅拌进行交联反应；离心，弃上清，收集沉淀并重溶，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白；步骤(1)中所述的重组霍乱毒素B亚基蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；步骤(1)中所述的重组霍乱毒素B亚基蛋白优选是将霍乱弧菌的霍乱毒素B亚基蛋白基因进行原核表达得到的重组蛋白；所述的霍乱毒素B亚基蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，是在该基因两端分别添加5’-BamHI和3’-XhoI酶切位点得到；所述的原核表达的载体优选为pET-32a载体；步骤(1)中所述的表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株优选为大肠杆菌；步骤(1)中所述的诱导表达的条件优选为：终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)30℃诱导表达6h；步骤(2)中所述的洗涤的具体操作优选为：在破碎后的菌体中加入PBS重悬，然后离心，弃上清；重复上述操作2～4次；所述的离心的条件优选为12000rpm离心10min；步骤(2)中所述的变性液包含如下终浓度的组分：8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris，pH＝8.0；步骤(2)中所述的超声的条件优选为功率200W，工作时间/间歇时间5sec/5sec；步骤(2)中所述的变性处理的条件优选为37℃变性处理2h；步骤(2)中所述的离心的条件优选为12000rpm离心10min；步骤(2)中所述的过滤除杂优选为采用0.45μm滤膜过滤杂质；步骤(3)中所述的镍柱纯化的具体操作优选为：清液上镍柱，使用20mmol/L咪唑洗脱液冲洗杂蛋白后，再使用500mmol/L咪唑洗脱液冲洗目的蛋白；步骤(4)中所述的透析的条件为4℃透析10～12h；步骤(4)中所述的透析的过程中使用的透析袋优选进行如下活化处理：透析袋加入1mMEDTA2Na和2wt％NaHCO3中，放入微波炉中火煮沸15min，取出后冷却，用ddH2O清洗三次，待冷却后加入1mMEDTA2Na重复煮沸，冷却；步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液中壳聚糖的浓度优选为1mg/mL，醋酸的体积分数优选为1％，pH＝5；步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液的配制方法优选为：将0.1g壳聚糖溶于100mL体积分数为1％的醋酸溶液中，调节pH值为5，过滤除去不溶杂质，得到1mg/mL的壳聚糖醋酸溶液；步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液、复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白和三聚磷酸钠溶液的体积比优选为5:5:4，其中，复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白的初始浓度优选为0.5mg/mL，三聚磷酸钠的初始浓度优选为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)表达：将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达，然后将菌体破碎，分离，收集破碎后的菌体；(2)变性：步骤(1)收集的破碎后的菌体洗涤后加入变性液，超声至澄清，然后30～40℃变性处理1.5～2.5h；离心，收集上清，过滤除杂，得到清液；(3)纯化：将步骤(2)制得的清液采用镍柱纯化，得到重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(4)复性：将步骤(3)中制得的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白依次在8M、6M、4M、2M和0M尿素溶液中透析，得到复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(5)交联：冰浴条件下，将壳聚糖/醋酸溶液与步骤(4)制得的复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白混合均匀，调整体系pH值为5.3～5.8；然后20～40℃搅拌处理5～15min，随后边搅拌边缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，其中，交联剂三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比1:5；滴加完成后继续搅拌进行交联反应；离心，弃上清，收集沉淀并重溶，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)表达：将表达重组霍乱毒素B亚基蛋白的菌株诱导表达，然后将菌体破碎，分离，收集破碎后的菌体；(2)变性：步骤(1)收集的破碎后的菌体洗涤后加入变性液，超声至澄清，然后30～40℃变性处理1.5～2.5h；离心，收集上清，过滤除杂，得到清液；(3)纯化：将步骤(2)制得的清液采用镍柱纯化，得到重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(4)复性：将步骤(3)中制得的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白依次在8M、6M、4M、2M和0M尿素溶液中透析，得到复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白；(5)交联：冰浴条件下，将壳聚糖/醋酸溶液与步骤(4)制得的复性后的重组霍乱毒素B亚基纯化蛋白混合均匀，调整体系pH值为5.3～5.8；然后20～40℃搅拌处理5～15min，随后边搅拌边缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，其中，交联剂三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比1:5；滴加完成后继续搅拌进行交联反应；离心，弃上清，收集沉淀并重溶，得到重组霍乱毒素B亚基蛋白。2.根据权利要求1所述的重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的重组霍乱毒素B亚基蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的重组霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的变性液包含如下终浓度的组分：8mol/L尿素，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：樊惠英，王诚诚，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44