一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒，包括：包被有包被原的酶标板、黄樟素标准品溶液、黄樟素特异性抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；包被原为黄樟素偶联抗原，酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，黄樟素特异性抗体是以黄樟素偶联抗原作为免疫原制备获得；所述黄樟素偶联抗原是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5‑(2‑溴‑2‑丙烯‑1‑基)‑1,3‑苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测黄樟素的方法。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测样品中黄樟素的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

An enzyme-linked immunosorbent kit for detecting the content of the pigment and its application

The invention discloses an enzyme-linked immunoassay kit for safrole detection, which comprises: a sheep coated with original safrole-coupled antigen, safrole standard solution, safrole-specific antibody, enzyme-labeled second antibody, substrate chromogenic solution, terminating solution, washing solution and complex solution, and an enzyme-labeled second antibody. Anti-mouse antibody, safrole-specific antibody is prepared using safrole-coupled antigen as an immunogen; the safrole-coupled antigen is obtained by coupling safrole hapten with carrier protein, and the safrole hapten is prepared by reacting 5(2(2_propylene) Here it is. The invention also discloses a method for detecting the content of awe in the enzyme linked immunosorbent kit. The enzyme-linked immunosorbent kit provided by the invention can be used for the determination of safrole content in samples, and is simple in operation, low in cost, high in sensitivity, capable of on-site monitoring and suitable for screening a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒及其应用
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测黄樟素的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测烟用香精香料、烟草及烟草制品中黄樟素的残留量。
技术介绍
黄樟素又称黄樟油素、黄樟脑，无色或微黄色液体，不溶于水，易溶于氯仿、乙醚和其他非极性有机溶剂，有樟木气味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫苏等植物中，是许多食用天然精油如黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分。由于其舒适的气味，黄樟油曾经在食品、洗涤用品和化妆品中作为调味剂和调香剂。黄樟素类化合物主要包括黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素等。黄樟素也是非法生产毒品摇头丸的一个重要组成部分。由于试验表明黄樟素对老鼠有致肝肿瘤的效果，因此，各国对黄樟素进行了限量规定。2001年，欧盟委员会规定黄樟素和异黄樟素的总使用限量，食品和饮料中为1mg/kg，含酒精饮料为5mg/kg。2005年，欧洲委员会将黄樟素列为怀疑弱致癌物质，虽然没有规定每日限量，但要求设置的尽可能低。我国于2005年实施的《易制毒化学品管理条例》将黄樟素列为第一类易制毒化学品。由于黄樟素类化合物的毒副作用，建立准确、快速、简便的黄樟素类化合物分析检测方法，对于评估食品、化妆品、烟草等安全性有着重要作用。目前，常用检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。由于以上方法均需先进检测仪器、检测费用昂贵、步骤繁琐、耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。本专利技术应用酶联免疫法，测定烟用香精香料、烟草及烟草制品中黄樟素的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低、非常容易推广等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够检测烟用香精香料、烟草及烟草制品中黄樟素残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。本专利技术试剂盒，包括：包被有包被原的酶标板、黄樟素标准品溶液、黄樟素特异性抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述包被原为黄樟素偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述黄樟素特异性抗体是以黄樟素偶联抗原作为免疫原制备获得；所述黄樟素偶联抗原是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：。所述黄樟素半抗原的制备具体包括以下步骤：取5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环1.0g，加无水二甲基亚砜（DMSO）50mL溶解，搅拌澄清，加氢氧化钾0.48g，加无水碘化钠0.20g，剧烈搅拌后，加氨基丙酸0.41g，100℃反应4h。停止反应，加水50mL，加1mol/L盐酸调节pH值到6，加乙酸乙酯80mL，萃取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，用体积比为1:5的乙酸乙酯/石油醚洗脱分离，得到半抗原产物丙酸黄樟素0.91g。所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。所述黄樟素特异性抗体为黄樟素单克隆抗体或黄樟素多克隆抗体，其中优选黄樟素单克隆抗体。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是由标记酶和抗抗体偶联得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括黄樟素标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。所述黄樟素标准品溶液6瓶，浓度分别为0µg/L，10µg/L，30µg/L，90µg/L，270µg/L，810µg/L。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物显色液A液和底物显色液B液组成，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。所述百分比为重量体积百分比，单位g/L。所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μL封闭液，25℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液优选为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液优选为pH值为7.1~7.5，含有1%~3%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。所述百分比为重量体积百分比，单位g/L。本专利技术的检测原理为：在微孔条上预包被黄樟素偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入黄樟素特异性抗体溶液，样本中的黄樟素与酶标板上包被的黄樟素偶联抗原竞争黄樟素特异性抗体，加入酶标二抗进行放大作用，用底物显色液显色，样本吸光度值与黄樟素的残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中黄樟素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样本中黄樟素残留量的浓度范围。。本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测黄樟素的方法，它包括步骤：（1）样品前处理；（2）用试剂盒进行检测；（3）分析检测结果。本专利技术检测黄樟素的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中黄樟素的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，检测速度快、检测成本低，非常容易推广。本专利技术的半抗原具有适当末端活性基团，修饰位点及间隔臂长度选择合适，且能最大程度模拟黄樟素的分子结构，以此半抗原为基础开发的试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。附图说明图1：黄樟素半抗原合成路线图，图2：试剂盒标准曲线图（该图为摘要附图）。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1检测黄樟素的酶联免疫试剂盒各组分的制备1、黄樟素半抗原的制备取5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环1.0g，加无水DMSO50mL溶解，搅拌澄清，加KOH0.48g，加无水碘化钠0.2g，剧烈搅拌后，加氨基丙酸0.41g，100℃反应4h。停止反应，加水50mL，加1mol/L盐酸调节pH值到6，加乙酸乙酯80mL，萃取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚（v/v，1/5）洗脱分离，得到丙酸黄樟素半抗原产物0.91g，收率87.37%。取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，1H-NMR（CDCl3,300MHz）δ：11.0（1H,-COOH），6.90（1H,ArH,J=6.864），6.68（1H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒，包括：包被有包被原的酶标板、黄樟素标准品溶液、黄樟素特异性抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，其特征在于：所述包被原为黄樟素偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述黄樟素特异性抗体是以黄樟素偶联抗原作为免疫原制备获得；所述黄樟素偶联抗原是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5‑(2‑溴‑2‑丙烯‑1‑基)‑1,3‑苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测黄樟素的酶联免疫试剂盒，包括：包被有包被原的酶标板、黄樟素标准品溶液、黄樟素特异性抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，其特征在于：所述包被原为黄樟素偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体，所述黄樟素特异性抗体是以黄樟素偶联抗原作为免疫原制备获得；所述黄樟素偶联抗原是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述黄樟素半抗原的制备反应过程如下：。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述黄樟素特异性抗体为黄樟素单克隆抗体或黄樟素多克隆抗体，其中优选黄樟素单克隆抗体。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶。6.如权利要求1或5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎，刘惠民，鲁亚辉，李旭，赵乐，崔华鹏，樊美娟，王晓瑜，贾芳芳，余晶晶，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41