一种含氯芳香化合物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种含氯芳香类化合物及其制备方法和用途，特点是该含氯芳香类化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO：M2014086的焦曲霉通过微生物发酵培养来获取含氯芳香类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，凝胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该含氯芳香类化合物具有抗哈维弧菌作用，可以作为抗鱼类致病菌哈维弧菌作用的新药物成分。

Chlorinated aromatic compound and preparation method and use thereof

The invention discloses a chlorinated aromatic compound, a preparation method and a use thereof, characterized by the structural formula of the chlorinated aromatic compound as shown in I. The preparation method comprises the steps of obtaining the fermented product of the chlorinated aromatic compound by microbial fermentation of Aspergillus pyrogena with the preservation number CCTCC NO: M2014086, and then obtaining the fermented product of the chlorinated aromatic compound by microbial fermentation. The fermentation products were soaked in methanol and ethyl acetate, and crude extract was obtained. The crude extract was separated and purified by decompressing silica gel column chromatography, gel column chromatography, middle pressure column chromatography and reverse phase semi high performance liquid chromatography. The advantage is that the chlorinated aromatic compounds have anti Harvey Vibrio and can be used as anti fish pathogenic bacteria Harvey. New components of Vibrio.

【技术实现步骤摘要】
一种含氯芳香化合物及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种含氯类芳香化合物，尤其是涉及一种用海绵共生真菌制备含氯类芳香化合物的方法以及该类化合物在制备抗鱼类致病菌哈维弧菌中的应用。
技术介绍
含卤素的天然产物十分稀少，海洋微生物由于具有来源丰富、生长环境多样、代谢途径特殊等特点，是最大的含卤素天然产物的生产者。本专利技术人研究得知，海绵共生真菌Aspergillusustus.（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2014086）的固体发酵的乙酸乙酯提取物有较好的抗弧菌活性，遂对其天然产物进行分离。目前尚未见该化合物的化学结构及抗弧菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有抗哈维弧菌活性的含氯芳香化合物及其制备方法和用途。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种含氯芳香化合物，该化合物的结构式如Ⅰ所示：（I）。上述含氯芳香化合物的制备方法，具体包括如下步骤：（1）发酵生产将保藏号为CCTCCNO:M2014086的焦曲霉（Aspergillusustus）在含有固体PDA培养基的平板上划线活化，置于28℃培养箱中培养5天；用灭过菌的牙签在平板上挑取一个单菌落接种到液体PDA培养基中，然后置于摇床上培养，温度25℃，转速为180rpm/min，培养2天后收集为种子液，然后将种子液按体积比5-20%的接种量接种到固体大米培养基中，然后将大米培养基静置发酵培养40天，温度28℃，获得发酵物；（2）浸膏的获得将上述发酵物加入甲醇中，超声破碎后放置过夜，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；（3）化合物的分离精制将上述粗浸膏首先用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为10:3的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分；采用二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱剂，对洗脱组分进行凝胶柱层析（LH-20），收集洗脱组分；将洗脱组分再经过反相中压柱色谱分离，采用甲醇和水为洗脱剂，梯度是从体积分数20%甲醇线性洗脱到80%甲醇，洗脱时间为120分钟，流速为20mL/min，收集出峰时间为70-80分钟的流分，最后该流分经半制备反相高效液相色谱分离纯化得到含氯芳香类化合物，其结构如式I所示：（I）。所述的固体大米培养基的配制方法如下：将80g大米和35g海盐溶于120mL海水中配制而成。所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1；所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱剂为甲醇与水按体积比55：45的比例混合而成。上述含氯芳香类化合物的用途，所述的含氯芳香类化合物在用于制备鱼类致病菌哈维弧菌抑制剂方面的用途。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种含氯芳香类化合物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取含氯芳香类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，凝胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该含氯芳香类化合物具有抗哈维弧菌作用，可以作为抗鱼类致病菌哈维弧菌作用的新药物成分。上述焦曲霉（Aspergillusustus），该菌为DJ003菌株，保藏编号为CCTCCNO.M2014086，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一种含氯芳香类化合物结构式如Ⅰ所示：（I）。实施例2如I式所示的含氯芳香类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：（1）发酵生产将保藏号为CCTCCNO:M2014086的焦曲霉（Aspergillusustus）在含有固体PDA培养基的平板上划线活化，置于28℃培养箱中培养5天；用灭过菌的牙签在平板上挑取一个单菌落接种到液体PDA培养基中，然后置于摇床上培养，温度25℃，转速为180rpm/min，培养2天后收集为种子液，然后将种子液按体积比5-20%的接种量接种到固体大米培养基中，然后将大米培养基静置发酵培养40天，温度28℃，获得发酵物；其中固体大米培养基的配制方法如下：将80g大米和35g海盐溶于120mL海水中配制而成；（2）浸膏的获得将上述发酵物加入甲醇中，超声破碎后放置过夜，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；（3）化合物的分离精制将上述粗浸膏首先用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为10:3的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分；采用二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱剂，对洗脱组分进行凝胶柱层析（LH-20），收集洗脱组分；将洗脱组分再经过反相中压柱色谱分离，采用甲醇和水为洗脱剂，梯度是从体积分数20%甲醇线性洗脱到80%甲醇，洗脱时间为120分钟，流速为20mL/min，收集出峰时间为70-80分钟的流分，最后该流分经半制备反相高效液相色谱分离纯化得到含氯芳香类化合物，其结构如式I所示：（I）。其中二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1；所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱剂为甲醇与水按体积比55：45的比例混合。该化合物Ⅰ淡黄色粉末，分子式C15H16NO6Cl，阳离子HRESIMSm/z：342.0795[M+H]+，1H和13C-NMR数据见表1。表1化合物Ⅰ的1H和13CNMR数据（600和150MHz，CDCl3）实施例3体外抗哈维弧菌活性的测试（96孔板抑菌法）（1）实验样品被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测活性。该实验使用的指示菌为哈维弧菌。（2）实验方法96孔板抗菌测试方法：将待测化合物逐级稀释在20wt％DMSO/盐水中，并转移10µL到96孔平底微孔板中。在需氧条件下，将指示菌株于30℃条件下在TSA培养基中培养20小时。加入一系列不同浓度的化合物置于TSA培养基中，并接种弧菌菌株，哈维弧菌在28℃培养40小时。8μg/ml链霉素用作阳性对照，DMSO溶液作为阴性对照。待测化合物的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。培养结束后，测定600nm下吸光值，根据如下公式计算抑制率。抑制率（%）=(ODR-OD)/(ODR-ODB)ODR：菌液对照孔吸光值；ODB：空白吸光值；OD：样品测定孔吸光值。（3）实验结果在96孔板抗弧菌测试中，不同浓度的化合物Ⅰ对哈维弧菌抑制结果分别见表2。表2不同浓度的化合物Ⅰ对哈维弧菌的抑制率（%）由上表可知化合物Ⅰ具有显著的抗哈维弧菌的作用，可以作为抗鱼类致病菌哈维弧菌作用的新药物成分。上述说明并非对本专利技术的限制，本专利技术也并不限于上述举例。本
的普通技术人员在本专利技术的实质范围内，作出的变化、改型、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含氯芳香化合物，其特征在于该化合物的结构式如Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种含氯芳香化合物，其特征在于该化合物的结构式如Ⅰ所示：2.一种权利要求1所述的含氯芳香化合物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：(1)发酵生产将保藏号为CCTCCNo:M2014086的焦曲霉(Aspergillusustus)在含有固体PDA培养基的平板上划线活化，置于28℃培养箱中培养5天；用灭过菌的牙签在平板上挑取一个单菌落接种到液体PDA培养基中，然后置于摇床上培养，温度25℃，转速为180rpm/min，培养2天后收集为种子液，然后将种子液按体积比5-20％的接种量接种到固体大米培养基中，然后将大米培养基静置发酵培养40天，温度28℃，获得发酵物；(2)浸膏的获得将上述发酵物加入甲醇中，超声破碎后放置过夜，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；(3)化合物的分离精制将上述粗浸膏首先用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为10:3的石油醚/乙酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁立建，何山，邱盼盼，崔巍，斯拉瓦·爱泼斯坦，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33