本发明专利技术提供了一种能够与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：L‑P‑Q‑R‑L‑R‑T。本发明专利技术还提供了一种肺炎支原体感染血清学诊断试剂盒，所述试剂盒中含有上述与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽。另外，本发明专利技术还提供了一种基于噬菌体展示多肽的肺炎支原体诊断试剂盒，该试剂盒中包含有核心噬菌体，其中核心噬菌体为展示上述多肽的噬菌体。本发明专利技术所提供的多肽和其相应的核心噬菌体的灵敏度和特异度高，具有良好的临床诊断价值。
A polypeptide specifically associated with Mycoplasma pneumoniae positive serum and diagnostic kit
The present invention provides a polypeptide which can specifically bind to Mycoplasma pneumoniae positive serum. The amino acid sequence of the polypeptide is shown as SEQ ID NO:1: L_P_Q_R_L_R_T. The invention also provides a serological diagnostic kit for Mycoplasma pneumoniae infection, wherein the kit contains the polypeptide specifically bound to the positive serum of Mycoplasma pneumoniae. In addition, the invention also provides a diagnostic kit for Mycoplasma pneumoniae based on phage display polypeptide, which contains a core phage, wherein the core phage is a phage displaying the polypeptide. The polypeptide and its corresponding core phage provided by the invention have high sensitivity and specificity, and have good clinical diagnostic value.
【技术实现步骤摘要】
一种与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽以及诊断试剂盒
本专利技术提供了能够与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽，以及基于多肽的诊断试剂盒，更涉及了一种基于噬菌体展示多肽的肺炎支原体诊断试剂盒，属于生物制剂领域。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是介于病毒和细菌之间的原核细胞型生物，由其感染引起的病理改变以间质性肺炎为主，约占人和动物非细菌性肺炎的1/2。MP传染性强，尤其易传播于儿童，是社区获得性肺炎的主要病原，因此MP肺炎的早期确诊极为重要。目前肺炎支原体感染主要采用MP的分离培养、血清学检测、PCR检测及物理诊断等方法进行诊断，尚缺乏灵敏、特异的诊断抗原用于MP感染的血清学诊断。有研究采用生物信息学方法预测肺炎支原体P1蛋白C端作为抗原并进行了血清学探索；StevenP等研究表明肺炎支原体P40和P90具有较强的抗原性；另外，有研究表明肺炎支原体P30蛋白的N端含有重要的表位。以往这些研究都是基于传统的蛋白表达与纯化，其操作繁琐、成本高昂且特异性较低。而长的肽段多以空间构象形式存在，其中的优势表位一般只含有5-7个氨基酸或单糖残基，是抗原与抗体结合的关键位点，因此筛选病原体的优势表位成为近年来血清学与疫苗学研究的重点。表位(epitope)又叫抗原决定簇(antigenicdeterminant)，通常只有位于抗原表面的表位易与抗体结合，称之为功能性表位，模拟表位则是构象表位上不连续的氨基酸通过空间构象形成的结构，其序列可能与病原体本身蛋白有一定同源性，也可能不具有相似性。筛选优势模拟表位不仅可以避免合成长肽段和表达纯化重组蛋白时的繁琐，而且能克服长链氨基酸因螺旋或折叠导致其与抗体的亲和性不高等缺点，因此成为表位研究的重点，广泛应用于诊断制剂、疫苗研制和蛋白质相互作用关键结合位点的确定等领域。1985年，Smith首次创建了噬菌体展示技术。1990年，Scott等将噬菌体随机肽库技术应用于筛选抗原表位，获得了与原始抗原性质、结构完全不同，但保留了其免疫原性和免疫反应性的模拟表位。利用该技术不但可以揭示抗原分子的结构和功能、制备广谱疫苗，也可筛选具有高亲和性的优势抗原表位，以优化设计灵敏、特异的ELISA试剂盒，为病原体感染的血清学诊断提供基础。
技术实现思路
本专利技术解决了
技术介绍
中的不足，提供了一种能够与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽和展示该多肽的核心噬菌体，所述多肽和其相应的核心噬菌体的灵敏度和特异度高，具有良好的临床诊断价值。实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：一种与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：L-P-Q-R-L-R-T。本专利技术还提供了一种肺炎支原体血清学诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，所述试剂盒中含有上述与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽。本专利技术还进一步提供了一种基于噬菌体展示多肽的肺炎支原体诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，试剂盒中还包含有核心噬菌体，其中核心噬菌体为展示上述多肽的噬菌体。以上试剂盒中，所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的TBST缓冲液，其pH为7.6，所述封闭液为含5％BSA的TBS缓冲液，所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液。将本专利技术所提供的噬菌体及其相应的多肽进行ELISA反应，结果表明：代表性噬菌体克隆均能与肺炎支原体阳性血清发生特异结合，展示多肽序列的核心噬菌体P1能与不同的临床血清发生结合；固相合成的多肽与不同的临床血清发生反应，其灵敏度为80.0％，特异度为97.1％，ROC曲线下的面积AUC＝0.94；AUC值大于0.9，表示准确性较高，ELISA结果可信度较高，具有较好的临床诊断价值。与现有技术相比，本专利技术中将噬菌体应用于血清学诊断具有以下显著的优势：本专利技术利用噬菌体展示随机肽库筛选能与肺炎支原体阳性血清特异结合的噬菌体，获得MP的优势模拟表位，从噬菌体展示随机7肽库中筛选到的多肽可能为MP的模拟表位，能与MP阳性血清特异结合，可用于MP感染的血清学诊断。噬菌体侵染大肠杆菌，繁殖速度快，易于实现大批量生产；噬菌体结构紧密，耐恶劣环境强，对检测的条件要求不高，使试验易于操作；敏感度和特异度高，能够达到快速、灵敏的诊断要求。因此，将噬菌体用于肺炎支原体的血清学诊断，对提高肺炎支原体感染的临床诊断效率具有重要意义。附图说明图1为琼脂糖凝胶电泳分析提取的部分噬菌体单链DNA图；图2为噬菌体克隆与肺炎支原体感染阳性血清、健康者血清及牛血清白蛋白的ELISA反应性图；图3为斑点免疫印迹法检测噬菌体与肺炎支原体阳性血清的特异结合图；图4为合成的多肽和不同的临床血清的ELISA反应图；图5为合成的多肽和不同临床血清ELISA反应的ROC曲线图。具体实施方式下面结合具体实验步骤对本专利技术做详细具体的说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。下述实验中利用纯化的肺炎支原体阳性混合血清为靶分子，对噬菌体展示随机7肽库进行生物淘选，筛选到能与肺炎支原体阳性混合血清特异结合的噬菌体，并以固相合成的7肽当做包被抗原，检测噬菌体以及外源多肽与不同临床血清的反应情况，以证明该噬菌体及其多肽在肺炎支原体血清学诊断中的应用价值。材料与方法：将肺炎支原体感染者的阳性混合血清和阴性混合血清(来自郴州市第一人民医院)分别用饱和(NH4)2SO4法进行纯化：往血清中加入等体积生理盐水，混匀后缓慢滴加2倍体积的饱和(NH4)2SO4，经离心后用生理盐水溶解沉淀物；缓慢滴加2/3体积的饱和(NH4)2SO4，再次离心弃上清，用生理盐水溶解沉淀物；加入1/2体积的饱和(NH4)2SO4，离心后用2mL生理盐水溶解沉淀物；用Millipore超滤离心管进行浓缩并去除无机盐离子；BCA法测蛋白浓度后-80℃保存备用。最终获得纯化的阳性血清约2.96mg，阴性血清约3.02mg。噬菌体展示随机肽库的淘选：对噬菌体展示七肽库进行4轮生物淘选，步骤简述如下：第一轮以100μL纯化的阳性血清(100μg/mL)包被ELISA板，经封阻、结合、洗涤(0.1％TBST)、洗脱(0.2M甘氨酸-HCl，pH＝2.2)、中和(1MTris-HCl,pH＝9.1)等步骤收集噬菌体，再用空的ELISA板进行反向吸附，以排除与ELISA板吸附的非特异噬菌体，然后用纯化的阴性血清为包被抗原，经封闭、吸附、收集未吸附的噬菌体，以排除可能与阴性血清结合的噬菌体，对噬菌体进行滴度测定后，取1μL进行扩增。随后以此方法对其进行第二到第四轮生物淘选，淘选的基本步骤与第一轮相似，但降低阳性血清的包被浓度(60μg/mL)，升高洗涤液的浓度(0.3％TBST)，以尽量排除非特异性吸附，根据产出与投入的噬菌体滴度，计算每轮生物淘选的产率，结果如表1所示。表1亲和淘选的产出与投入比DNA测序与分析：为了确定经生物淘选后而富集的特异噬菌体的外源性氨基酸序列，将第4轮淘选后的产物进行滴度测定，将第4轮淘选后的产物进行铺板培养，从噬菌斑小于100个的平板上随机挑取40个克隆，提取单链DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：L‑P‑Q‑R‑L‑R‑T。
【技术特征摘要】
1.一种与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：L-P-Q-R-L-R-T。2.一种肺炎支原体感染血清学诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，其特征在于所述试剂盒中含有权利要求1所述的与肺炎支原体阳性血清特异结合的多肽。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的TBST缓冲液，其pH为7.6，所述封闭液为含5％BS...
【专利技术属性】
技术研发人员：史文元，曾焱华，赵兰华，滕文友，徐玉娟，江杨华，李胜涛，
申请(专利权)人：郴州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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