一种层出镰刀菌的LAMP检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种层出镰刀菌的LAMP检测引物及其应用，所述检测引物是由1对外侧引物F3/B3、1对内侧引物FIP/BIP和1对环引物Loop F/Loop B组成的组合物，该LAMP检测引物组合物被应用于检测层出镰刀菌，以及玉米作物是否感染了玉米穗腐病。本发明专利技术设计的层出镰刀菌LAMP检测引物组合物特异性强、扩增效果好，检测方法无需对病原菌进行分离纯化及培养，简便快捷，实用性强，灵敏度高，结果准确可靠，可用于玉米植株组织中层出镰刀菌发病前期、初期的早期诊断。

A primer for detection of Fusarium graminearum by LAMP and its application

The invention discloses a LAMP detection primer for Fusarium spp. and its application. The detection primer is a composition composed of a pair of external primers F3/B3, a pair of internal primers FIP/BIP and a pair of ring primers Loop F/Loop B. The LAMP detection primer composition is applied to detect Fusarium spp. and whether maize crops are infected with maize. Panicle rot disease. The LAMP detection primer composition designed by the invention has strong specificity and good amplification effect, and the detection method does not need to isolate, purify and cultivate pathogenic bacteria. The method is simple, fast, practical, high sensitivity, accurate and reliable, and can be used for early diagnosis of Fusarium spp. in maize plant tissues at early stage and early stage of pathogenesis. .

【技术实现步骤摘要】
一种层出镰刀菌的LAMP检测引物及其应用
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，涉及一种能引起玉米穗腐病的层出镰刀菌的LAMP检测引物，含有该检测引物的检测试剂盒，以及利用所述检测引物或检测试剂盒的LAMP检测方法。
技术介绍
玉米穗腐病是玉米生长后期的最常见病害之一，在玉米种植区普遍发生，发病率5～10%。感病品种发病率高达50%，甚至在个别严重地块可达100%，造成严重损失。玉米穗腐病由多种病原菌侵染所致，其中镰刀菌为主要病原菌。镰刀菌在致病过程中能产生多种毒素，可促使细胞凋亡，对动植物机体造成多种病理损伤，给食物安全带来严重隐患。目前已报道的引起玉米穗腐病的镰刀菌在15种以上，其中层出镰刀菌为优势种群。层出镰刀菌属于半知菌门、瘤座饱属真菌，既可以危害大田农作物如玉米、高粱、水稻等，经济作物如芒果、芦笋、洋葱、大蒜等多种作物，也可以存在于土壤中。层出镰刀菌主要依靠风力传播，有伤口的玉米籽粒能被层出镰刀菌侵染导致玉米穗腐病发生。层出镰刀菌侵染作物会造成极其严重的损害，其分泌的次生代谢物如伏马毒素(Fumonisins)、单端孢霉烯族毒素类(Trichothecenes)、镰刀菌酸(Fusaricacid，FA)和玉米赤霉烯酮等对人畜安全也有很大影响。层出镰刀菌的形态具有多型性和变异性，仅依据形态特征进行病原菌的准确鉴定具有较大难度，并且传统鉴定方法存在检测周期长、工作量大、结果不准确等问题。因此，及时有效地对层出镰刀菌进行快速、准确检测，是防治其寄主植物病害发生、保证农产品质量安全的基础。传统的植物病原菌分离检测方法是先从病组织或土壤样品中分离获得病原菌菌株，再通过培养特性及显微形态观察进行分类鉴定，以明确病原菌种类。而病原菌的分离纯化培养至少需要3～5天，耗时费力，且在分离培养过程中极易污染各种杂菌，鉴定准确度较低。该方法易受人为因素和环境影响，要求经验丰富的专业人员才能完成，且对操作者的实验技能和实际经验有较高的要求。最重要一点，病原菌分离检测方法容易遗漏处于潜育期或出现隐症现象的病原菌，以致延误病情，导致病害暴发，从而耽误病害的及时防治。因此，传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要，建立一种快速、灵敏、准确的检测方法，对玉米穗腐病的防控具有重要意义。随着PCR技术和测序技术的发展，分子生物学技术为植物病原真菌的检测、鉴定和量化提供了新的方法和手段。一项好的分子检测技术应具有特异性强，灵敏度高，检测速度快，操作简单等优点。Notomi等于2000年开发了一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)，该技术利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增，其依赖于能够识别靶序列上6个不同区域即3'端的B3c、B2c和Blc区以及5'端的Fl、F2和F3区的4～6条特异性模板引物，在恒温条件下即可高效、快速、特异地扩增靶序列，实现病害的快速检测。该方法操作简单，不需要PCR仪等昂贵仪器，在恒温条件下即可扩增靶序列，尤其适合基层植保技术部门、检验检疫部门使用；检测速度快，无需对病原菌进行分离培养，可用于检测植物组织中存在病菌，仅需30min既可完成扩增，从而实现病原菌的快速准确检测。目前未发现将LAMP用于层出镰刀菌快速检测的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种层出镰刀菌的LAMP检测引物组合物，从而建立层出镰刀菌的LAMP快速检测体系。本专利技术的另一目的是提供一种层出镰刀菌的LAMP检测试剂盒。提供一种层出镰刀菌的LAMP检测方法，实现层出镰刀菌的快速、灵敏和特异分子检测，是本专利技术的又一专利技术目的。针对层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)的翻译延伸因子(EF-1alpha)基因序列，本专利技术利用在线LAMP引物设计软件PrimerExplorerV5software(http://primerexplorer.jp/lampv5e)设计出一套引起玉米穗腐病的层出镰刀菌的特异性LAMP检测引物组合物。本专利技术所述的层出镰刀菌LAMP检测引物组合物由1对外侧引物F3/B3、1对内侧引物FIP/BIP和1对环引物LoopF/LoopB组成，各引物的具体序列如下。F3：5'-AGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3'。B3：5'-TCCTGTCCACAACCTCAA-3'。FIP：5'-AAGTTCGAGACTCCTCGCTACTGAGGAAGTAGGATGAGGTATGA-3'。BIP：5'-CTCGGCCTTGAGCTTGTCAACAATAGGAAGCCGCTGAG-3'。LoopF：5'-TCACCGTCATTGGTATGTTGT-3'。LoopB：5'-AGGCGTACTTGAAGGAACC-3'。进而，本专利技术提供了一种层出镰刀菌的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒的每1mL检测溶液中含有：外侧引物F3和B3各0.25μM，内侧引物FIP和BIP各1μM，环引物LoopF和LoopB各0.5μM，2×LAMP反应混合液625μL，8UBst聚合酶25μL。上述LAMP检测引物组合物或者LAMP检测试剂盒被应用于检测是否存在有层出镰刀菌。进一步地，上述LAMP检测引物组合物或者LAMP检测试剂盒被应用于检测玉米作物是否感染了玉米穗腐病。本专利技术还提供了一种层出镰刀菌的LAMP检测方法，所述方法包括提取待检测作物或微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述LAMP检测引物组合物或者LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，采用下述任意一种方法检测是否存在层出镰刀菌。将扩增产物以琼脂糖凝胶电泳，出现梯形条带判断为阳性，存在层出镰刀菌，没有出现条带判断为阴性，不存在层出镰刀菌。或者，在LAMP反应扩增产物中加入SYBRgreenⅠ显色剂并混匀，在254nm紫外灯下进行可视化显色检测，观察到产生绿色荧光为阳性，存在层出镰刀菌，不产生绿色荧光为阴性，不存在层出镰刀菌。进而，本专利技术上述检测方法中，所述LAMP扩增的反应条件为在60～65℃下温育30～75min。所述LAMP扩增反应条件优选为62℃温育30min。进一步地，当本专利技术所述检测方法用于检测病原菌纯培养物时，优选采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取病菌菌株的DNA。用于检测植物组织中存在的层出镰刀菌病原菌时，优选采用NaOH快速裂解法提取层出镰刀菌DNA。更具体地，利用LAMP检测引物组合物检测层出镰刀菌时，优选建立的LAMP检测反应体系为：外侧引物F3和B3各0.2μM，内侧引物FIP和BIP各0.8μM，环引物LoopF和LoopB各0.4μM，2×LAMPPCR等温扩增反应混合液12.5μL，8UBst聚合酶0.5μL，DNA模板1.0μL，以灭菌超纯水补足至25μL。进而，当利用LAMP检测试剂盒检测层出镰刀菌时，优选取1.0μLDNA模板，加入20.0μL所述试剂盒检测溶液和4.0μL灭菌超纯水进行LAMP扩增。优选地，本专利技术取2.0μLLAMP扩增产物，采用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测条件为电压80V，电流110A，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种层出镰刀菌的LAMP检测引物，是由1对外侧引物F3/B3、1对内侧引物FIP/BIP和1对环引物Loop F/Loop B组成的引物组合物，各引物序列如下：F3：5'‑AGTACCAGTGATCATGTTCTTG‑3'；B3：5'‑TCCTGTCCACAACCTCAA‑3'；FIP：5'‑AAGTTCGAGACTCCTCGCTACTGAGGAAGTAGGATGAGGTATGA‑3'；BIP：5'‑CTCGGCCTTGAGCTTGTCAACAATAGGAAGCCGCTGAG‑3'；Loop F：5'‑TCACCGTCATTGGTATGTTGT‑3'；Loop B：5'‑AGGCGTACTTGAAGGAACC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种层出镰刀菌的LAMP检测引物，是由1对外侧引物F3/B3、1对内侧引物FIP/BIP和1对环引物LoopF/LoopB组成的引物组合物，各引物序列如下：F3：5'-AGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3'；B3：5'-TCCTGTCCACAACCTCAA-3'；FIP：5'-AAGTTCGAGACTCCTCGCTACTGAGGAAGTAGGATGAGGTATGA-3'；BIP：5'-CTCGGCCTTGAGCTTGTCAACAATAGGAAGCCGCTGAG-3'；LoopF：5'-TCACCGTCATTGGTATGTTGT-3'；LoopB：5'-AGGCGTACTTGAAGGAACC-3'。2.一种层出镰刀菌的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒的每1mL检测溶液中含有：外侧引物F3和B3各0.25μM，内侧引物FIP和BIP各1μM，环引物LoopF和LoopB各0.5μM，2×LAMP反应混合液625μL，8UBst聚合酶25μL，其中，所述外侧引物F3/B3、内侧引物FIP/BIP和环引物LoopF/Loop的引物序列如下：F3：5'-AGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3'；B3：5'-TCCTGTCCACAACCTCAA-3'；FIP：5'-AAGTTCGAGACTCCTCGCTACTGAGGAAGTAGGATGAGGTATGA-3'；BIP：5'-CTCGGCCTTGAGCTTGTCAACAATAGGAAGCCGCTGAG-3'；LoopF：5'-TCACCGTCATTGGTATGTTGT-3'；LoopB：5'-AGGCGTACTTGAAGGAACC-3'。3.一种层出镰刀菌的LAMP检测方法，是提取待检测作物或微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，王春伟，王建明，张作刚，王美琴，李新凤，郝晓娟，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14