紫云英LEAFY基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了紫云英LEAFY基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述紫云英LEAFY基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。超表达LEAFY基因拟南芥株系的出苗至抽薹天数比野生型平均早3d，出苗至开花天数比野生型平均早2d，开花数比野生型平均多1.79个，显示转紫云英LEAFY基因拟南芥株系抽薹天数、开花天数均显著早于野生型。这表明了紫云英LEAFY基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能，将该基因应用于紫云英性状改良，具有良好的应用前景。

Astragalus LEAFY gene and its application

The invention provides Astragalus LEAFY gene and its application, belonging to the technical field of plant genetic engineering. The cDNA sequence of the LEAFY gene is shown as SEQ ID No.1, and the encoded protein sequence is shown as SEQ ID No.2. The days from seedling emergence to bolting were 3 days earlier than those of wild type, 2 days earlier than that of wild type, and 1.79 more than that of wild type. The results showed that the days of bolting and flowering of transgenic Arabidopsis thaliana were significantly earlier than those of wild type. This indicated that LEAFY gene was closely related to flowering and had the function of regulating flowering time. The application of LEAFY gene in the improvement of characters of Chinese milk vetch has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
紫云英LEAFY基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体地说，涉及紫云英LEAFY基因、其编码蛋白及其在花期调控中的应用。
技术介绍
紫云英(AstragalussinicusL.)，豆科黄芪属越年生草本植物，原产中国，是重要的绿肥作物，同时也是优质的豆科牧草和蜜源植物，中国、韩国、日本等亚洲国家普遍种植。紫云英是重要的清洁有机肥源，在绿肥中占有相当高的比例，对优化土壤的理化性质，培肥土壤，改善土壤生态环境发挥着巨大作用。上世纪八十年代以来，随着化肥工业的发展，长期大量使用化肥、农药，单纯追求作物产量的耕作和施肥方式，使得土壤资源面临着严重的生产和生态危机。紫云英对土壤资源的可持续利用，具有重要意义，近年来，国家对于紫云英的科研和生产的投入大大增加。成花是植物从营养生长向生殖生长的关键转换，同时也是是实现世代交替的中心环节，在很大程度上决定了植物繁殖的成功与否。紫云英按开花早晚可分特早花型、早花型、中花型和晚花型，开花时间直接决定了有效生长季的长短。作为绿肥，紫云英的种植和收获时间取决于主作物，保证紫云英产量的同时还要与主作物的生育期相协调。在合适的时间促使或避免开花，根据当地的耕作制度选育花期适当的品种是重要的育种目标。因此，成花基因研究对紫云英生长发育及遗传改良具有重要意义。但对于紫云英成花机制的研究，国内外均无深入的研究，开花相关基因在此过程中的作用还不清楚。LEAFY基因是植物界所特有的基因，属于花原基分化特异性基因，控制着茎尖分生组织向花序分生组织的转变，它不属于目前所知道的任何一个基因家族。已公布的LEAFY基因序列比对发现，不同植物LEAFY同源基因编码区长度变化不大，最长的为拟南芥，长为1275bp，编码424个氨基酸，最短的为桉树，长为1080bp，编码359个氨基酸。LEAFY基因在植物成花过程中发挥重要作用，控制花序分生组织向花分生组织的转变，以及植物的开花时间。在成花转变中，LEAFY基因的参与是花分生组织形成的关键。LEAFY基因在成花前表达于叶原基，但是当其表达量积累到一定水平后则抑制叶原基的启动，抑制分生组织细胞向营养生长发育的转变，从而使更多分生组织细胞形成花原基。LEAFY基因在维持花分生组织的正常功能、花启动、防止花分生组织的逆转等过程中均起作用。在拟南芥中超表达该基因可以使侧枝转变为花，并能使花期提前。超表达该基因可以使本来8-10年开花的杨树经6-7个月的营养生长后就能开花。除此之外，该基因还在花序和花发育的各个阶段中发挥着作用，在高等植物的营养生长和生殖的各个阶段都有广泛的表达，在生殖阶段，表达量明显增大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供紫云英LEAFY基因及其应用。本专利技术首先提供紫云英LEAFY基因，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因编码的蛋白，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本专利技术提供了含有上述编码紫云英LEAFY基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、宿主细胞或表达盒。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在促进植物提早抽薹中的应用。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在促进植物提前开花中的应用。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在增加植物开花数目中的应用。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。本专利技术提供了上述紫云英LEAFY基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。所述植物为紫云英、拟南芥。本专利技术提供的紫云英LEAFY基因序列如SEQIDNo.1所示，其编码蛋白序列如SEQIDNo.2所示。通过农杆菌介导法侵染拟南芥，将该基因转入拟南芥中，得到转紫云英LEAFY基因的拟南芥株系，结果发现转紫云英LEAFY基因的拟南芥株系出现抽薹提前，开花提前，抽薹天数比野生型平均早3d，开花天数比野生型平均早2d，开花数比野生型平均多1.79个。这表明了紫云英LEAFY基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。为开发调控成花的技术手段提供理论依据，同时为分子育种改良紫云英性状奠定基础。附图说明图1为实施例1目的片段电泳图，其中右泳道为markerDL2000；左泳道为目的片段。图2为5’RACE实验目的片段电泳图。图3为3’RACE实验目的片段电泳图。图4为LEAFY蛋白质二级结构预测及功能位点注释图。图5为利用MEGA5.2构建的LEAFY基因氨基酸序列的NJ系统进化树(数字为置信度)。bootstrep设置为1000，采用Jones-Thorton-Taylor模型构建NJ树。图6为LEAFY基因在紫云英不同器官中的表达量比较图。图7为超表达LEAFY基因拟南芥植株的PCR阳性检测，从左至右泳道依次是目的基因P1233CheckF/P1233R引物检测，泳道12为阴性对照。图8为生长32d后的拟南芥植株图片，左侧为野生型，右侧为转LEAFY基因拟南芥。图9为超表达紫云英LEAFY基因拟南芥的抽薹天数、开花天数和开花数统计。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂、材料均为市售可得。实施例1紫云英LEAFY基因的获得1.试验材料新鲜紫云英组织样本。2.RNA提取与cDNA第一链的合成常规方法提取RNA，使用Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit合成cDNA第一链。3.引物的设计及序列采用PrimerPremier5.0软件进行验证实验引物的设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。表1引物名称及序列4.5’RACE实验4.1引物的设计及序列利用转录组测序验证结果，采用PrimerPremier5.0软件设计两条特异性5’RACE引物，见表1。由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。4.2目的基因第一链cDNA的合成使用SUPERSCRIPTIIRT酶和引物GSP-1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成，使用RNaseMix对合成的cDNA进行去RNA处理。4.3使用DNAPurificationSystem:GLASSMAXDNAisolationspincartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。4.4使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C4.5使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增。4.6使用引物GSP-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增。4.7目的片段的回收纯化将第二轮P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.紫云英LEAFY，其特征在于，其具有：1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
2018.01.19 CN 20181005351601.紫云英LEAFY，其特征在于，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述的紫云英LEAFY的编码基因，其特征在于，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述紫云英LEAFY的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体，表达盒，宿主细胞或工程菌。4.权利要求1所述的紫云英LEAFY或权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贤，王建红，曹凯，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33