一株鱼源屎肠球菌R8的筛选及应用制造技术

本发明专利技术提供一株从鲫鱼肠道内筛选分离出的既安全又具有益生特性的屎肠球菌R8，菌株Enterococcus faecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15229，保藏日期为2018年1月17日。该菌株耐热性强，耐酸碱度宽泛，抗逆性高，益生性更加显著，同时对常见水产致病菌如维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均具有较明显抑制作用，能够作为饲料添加剂广泛应用与水产养殖中。

【技术实现步骤摘要】
一株鱼源屎肠球菌R8的筛选及应用
本专利技术属于水产用微生物添加剂
，涉及一种对水产常见致病菌维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌具有明显抑制作用的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)菌株的分离鉴定、安全性试验以及抗逆性能的鉴定及应用。
技术介绍
目前，随着人们对微生态产品的逐步认可和近年来政府对抗生素的使用限制愈来愈严，人们在寻求抗生素类产品的替代品时，将目光更多地转向了绿色、环保、高效的微生态产品。乳酸菌作为一类重要益生菌，同时也是动物肠道内的重要优势菌群，因其无毒、无残留、无副用等特点，越来越成为饲料添加剂的热门研究领域。不过由于乳酸菌类为厌氧菌，并且对高温耐受性不强，这为乳酸菌产品的应用与开发带来了障碍。而屎肠球菌具有乳酸菌类细菌中特有的抗逆性，在生产加工上有其独特的优势。因此，屎肠球菌在畜牧领域的微生态制剂，特别生物饲料添加剂应用技术上倍受亲睐。2008年中国农业部发布公告，在《饲料添加剂品种目录》中明确规定饲用微生物添加剂的种类，屎肠球菌位列其中，成为了微生态制剂常用乳酸菌菌种。大量事实证明，屎肠球菌制剂在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高饲料报酬、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果。尽管屎肠球菌被广泛应用，但在水产业方面，从水产动物自身中筛选出益生菌并应用的报道却相对较少。水产养殖中使用的很多益生菌并不是从水产动物或者生活环境中筛选出来，而是来自某些陆生动物，这就造成益生菌株无法定殖或不稳定。只有从宿主本身筛选出的土著微生物才可以更好地适应环境，更高效的抑制病原菌，而那些非分离自鱼类消化道的益生菌株，往往不能稳定地定殖在鱼类消化道中。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术缺陷，提供一株从鲫鱼肠道内筛选分离出的既安全又具有益生特性的益生菌。该菌株耐热性强，耐酸碱度宽泛，抗逆性高，益生性更加显著，同时对常见水产致病菌如维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均具有较明显抑制作用。利用16SrDNA方法鉴定该菌株为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，并对其安全性、抗逆性及应用进行了相关试验。本专利技术的屎肠球菌R8，菌株Enterococcusfaecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.15229，保藏日期为2018年1月17日。屎肠球菌R8是从鱼类肠道内分离筛选得到的，本专利技术采用鲫鱼。本专利技术的屎肠球菌R8能够应用于水产养殖，有效定殖于肠道发挥益生作用，显著提高水产生物存活率和增重率，对常见水产致病菌维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均有明显抑制作用。本专利技术的屎肠球菌R8可以以饲料添加剂的形式使用，优选的掺拌量为2w％，菌液浓度为1.0×108cfu/mL。本专利技术具有如下优点：(1)菌株来源于常见鱼类(鲫鱼)的肠道内容物，经分离筛选得到，被命名为屎肠球菌R8。对水产常见致病菌(维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌)具有明显抑制作用，为替代抗生素添加剂提供有利依据。(2)该菌株可耐受胃酸及小肠高胆盐环境，可在肠道内定殖从而发挥益生作用。(3)该菌株对高温耐受力较强，可耐受60℃，30min，70℃，5min存活率高达90％。这为该菌株作饲料添加剂并用于实际生产奠定基础。(4)动物试验证明，该菌株对原宿主无毒害作用，可作饲料添加剂使用。将该菌株制备为益生菌制剂，运用到饲料添加剂中，可大大削减水产饲料中抗生素对水环境的污染和人类健康的影响。减少细菌抗药性的产生，实现水产养殖业的可持续发展。附图说明图1：分离筛选的屎肠球菌株R8在MRS固体培养基上的生长状态。图2：屎肠球菌R8的革兰氏染色阳性反应(×1000)图3：16SrDNA基因PCR扩增检测结果。图中各泳道：M：Maker；1：菌株R8图4:基于16SrDNA序列构建系统发育树图5：耐胆盐试验结果图6：耐酸性试验结果图7：耐高温试验结果图8：屎肠球菌R8生长曲线具体实施方式下面对本专利技术进行进一步说明。为了叙述方便，本专利技术中的设备略去了必要或常规的操作步骤或条件，本领域技术人员能够根据反应的需要进行任意的调整。实施例1：益生菌菌株的分离鉴定一、菌株的分离样品取自市场购买的健康鲫鱼，体表用75％医用酒精消毒后，无菌解剖鲫鱼并取出肠道，按1∶10的比例加入预冷的灭菌生理盐水，样品用玻璃匀浆器充分匀浆，匀浆液按10倍系列稀释后进行MRS培养基平板涂布，37℃恒温培养24-36h后观察。选取边缘清晰、分散且大小在1mm左右的菌落进行纯培养。将纯培养物经形态学观察、革兰氏染色进行初步判定，对细菌呈单个、成对或链状的革兰氏阳性球菌进行传代保存。该专利技术的的菌株在MRS琼脂培养上的生长特性见图1，革兰氏染色特性见图2。该菌株属革兰氏阳性球菌，在MRS固体琼脂培养基上的菌落形态为圆形，成对或短链状排列，呈乳白色，表面光滑，边缘整齐，菌体直径大小约0.5-1.0mm。显微镜油镜下观察，菌株细胞呈球状，单生或成对，对生和链状较少。无芽孢，无鞭毛。二、对分离株的初步鉴定将上述分离的菌株命名为R8，通过生理生化鉴定管(杭州滨和微生物试剂有限公司)方法进行鉴定，包括：葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇、精氨酸双水解酶、胆汁七叶苷水解试验。该菌株的胆汁七叶苷水解试验呈阳性，可水解阿拉伯糖，发酵山梨醇等，将鉴定结果(见表1)与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)对比，发现菌株与肠球菌属屎肠球菌种的描述基本相一致，初步判定分离株R8为屎肠球菌。表1屎肠球菌R8生化鉴定结果三、对分离株R8种的确证在上述鉴定的基础上，对菌株R8进行16SrDNA基因序列检测，通过构建系统发育树分析来进一步确证菌种。(一)分离株基因组的提取步骤：采用煮沸法(陈光丽，2015)提取分离株的总DNA。(二)扩增16SrDNA基因的引物设计：扩增引物采用细菌通用引物,正向引物F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，反向引物R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。(三)PCR扩增16SrDNA基因以上述引物扩增菌株R8基因组的16SrDNA基因组，反应体系见表2。PCR反应程序为：95℃10min，94℃5min，55℃40s，72℃40s，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。取4LPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，胶电泳图像分析系统观察结果，将产物交由上海生物工程技术公司进行PCR产物的纯化和克隆测序。表2菌株R816SrDNA的PCR反应体系(四)基于16SrDNA序列构建系统发育树通过凝胶电泳试验，检测到一条大小为1523bp目的条带(见图3)；Blast比对表明与Enterococcusfaecium模式菌株DSM20477(AJ276355.1)序列同源性为99.87％，将测序结果提交GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获取登录号(MF928076)，再通过Blast把与菌株R8的16SrDNA同源性较高的同一属的18种细菌选出，用MEGA5.2软件对这19种序列进行同源性比对，利用Neighb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种屎肠球菌R8，菌株Enterococcus faecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15229，保藏日期为2018年1月17日。

【技术特征摘要】
1.一种屎肠球菌R8，菌株Enterococcusfaecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.15229，保藏日期为2018年1月17日。2.根据权利要求1所述的屎肠球菌R8，其特征在于，所述屎肠球菌R8是从鱼类肠道内分离筛选得到。3.根据权利要求1所述的屎肠球菌R8，其特征在于，所述屎肠球菌R8是从鲫鱼肠道内分离筛选得到。4.权利要求1所述的屎肠球菌R8在水产养殖中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用通过使屎肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙敬锋，毛晴，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12