Ogura CMS不育恢复基因Rfo制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域领域，具体涉及恢复基因RfoB、其表达载体及其应用。RfoB是以甘蓝Ogura CMS细胞质不育系为对象，根据恢复基因Rfo序列，结合甘蓝基因密码子偏好性，人工合成新的RfoB序列；将PRfo启动子，RfoB基因以及终止子E9‑T融合获得RfoB基因表达盒。构建其植物表达载体后利用农杆菌介导法直接转化甘蓝Ogura CMS细胞质不育系，获得甘蓝转基因植株，其育性恢复，转基因植株自交正常结籽，其作为父本导入其他甘蓝类Ogura CMS细胞质不育系后，携带RfoB基因的个体均能恢复育性。

【技术实现步骤摘要】
OguraCMS不育恢复基因RfoB、RfoB植物表达载体及其应用
本专利技术涉及基因工程领域领域，具体涉及人工合成的OguraCMS细胞质雄性不育恢复基因RfoB、RfoB植物表达载体及其在OguraCMS细胞质雄性不育恢复系创建中的应用。
技术介绍
目前，在芸苔属植物中被广泛使用的OguraCMS细胞质雄性不育于1968年在日本鹿儿岛的萝卜中发现(OguraH.Studiesonthenewmale-sterilityinJapaneseradish,withspecialreferencetotheutilizationofthissterilitytowardsthepracticalraisingofhybridseeds.MemFacAgricKagoshimaUniv,1968，6：39–78)，不育性状主要由线粒体上的orf138基因所控制(BonhommeS,BudarF,LancelinD,SmallI,DefranceMC,andPelletierG.SequenceandtranscriptanalysisoftheNco2.5-specificfragmentcorrelatedwithcytoplasmicmalesterilityinBrassicacybrids.MolGenGenet，1992，235:340–348)。orf138基因表达产物具有细胞毒性，通过影响花药绒毡层细胞线粒体活性而导致不育。后来，通过远缘杂交、胞质非对称融合等手段，将其线粒体先后转移到油菜、甘蓝类蔬菜等植物中，获得稳定的细胞质雄性不育系，并广泛应用于杂种一代的品种选育(PelletierG，PrimardC，VedelF，Chetrit,RemyR,Rousselle,RenardM.IntergenericcytoplasmichybridizationinCruciferaebyprotoplastfusion.MolGenetGenomics，1983，191(2):244-250；方智远，刘玉梅，杨丽梅，王晓武，庄木，张扬勇，孙培田.甘蓝显性核基因雄性不育与胞质雄性不育系的选育及制种.中国农业科学，中国农业科学2004,37(5):717-723)。甘蓝类蔬菜包括结球甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、芥蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝等不同变种，随着OguraCMS细胞质雄性不育导入不同甘蓝类蔬菜，越来越多的甘蓝类蔬菜采用OguraCMS细胞质雄性不育选育杂种一代(张艳王小佳李成琼宋洪元任雪松司军.甘蓝细胞质雄性不育材料分子鉴定及花器官形态对核背景的响应.园艺学报，2010，6：915-922)。由于OguraCMS细胞质雄性不育基因位于细胞质内，所有可育材料与其杂交后得到的后代均为100％不育，因此，位于不育材料(品种)中的优异性状无法被分离出来与其他优异性状进行组合而被再利用，其实质是对优异种质资源的再利用形成了技术封锁，对甘蓝类蔬菜优异育种材料的创新具有明显的阻碍作用。因此，有必要针对OguraCMS细胞质雄性不育系选育专门的恢复系。然而，到目前为止，仍没有针对OguraCMS细胞质雄性不育的甘蓝类蔬菜恢复系被报道。在甘蓝型油菜育种中，为实现基于OguraCMS细胞质雄性不育选育的杂种一代育性恢复，将来自萝卜的恢复基因Rfo通过种间杂交、细胞融合等技术导入油菜实现育性恢复，但在导入恢复基因的同时也将Rfo位点两侧冗余的萝卜基因组导入，导致获得的恢复系农艺性状不良、籽粒硫甙含量增加，且这些伴随产生的缺陷通过杂交、回交和系谱选育技术也难以解决(GiancolaS,MarhadourS,DesloireS,ClouetV,Falentin-Guyomarc'hH,LalouiW,FalentinC,PelletierG,RenardM,BendahmaneA,DelourmeR,andBudarF.CharacterizationofaradishintrogressioncarryingthefertilityrestorergeneRfoinrapeseed,usingtheArabidopsisgenomesequenceandradishgeneticmapping.TheorApplGenet,2003,107(8):1442-1451.)。后来，经过辐射处理去掉部分萝卜的渗入片段，在油菜中选择到低硫甙含量的恢复系R2000(Primard-BrissetC,PoupardJP,HorvaisR,EberF,PelletierG,RemardM,andDelourmeR.AnewrecombineddoublelowrestorerlinefortheOgu-INRAcmsinrapeseed(BrassicanapusL.).TheorApplGenet,2005,111(4):736-746)。甘蓝型油菜属于异源四倍体(AACC)，与二倍体甘蓝(CC)之间进行种间杂交能获得成功，但存在杂交成功率低，技术复杂，回交周期漫长的特点。如将带有恢复基因Rfo油菜材料与芥蓝进行种间杂交将Rfo恢复基因导入芥蓝OguraCMS不育系，得到花粉活力明显提高的BC2后代(YuHL,FangZY,LiuYM,YangLM,ZhuangM,LvHH,LiZS,HanFQ,LiuXP,ZhangYY.Developmentofanovelallele-specificRfomarkerandcreationofCMSfertility-restoredinterspecifichybridsinBrassicaoleracea.TheorApplGenet,2016,129(8):1625-1637；YuHL,LiZY,YangLM,LiuYM,ZhuangM,ZhangLG,LvHH,LiZS,HanFQ,LiuXP,FangZY,ZhangYY.MorphologicalandmolecularcharacterizationofthesecondbackcrossprogeniesofOgu-CMSChinesekaleandrapeseed.Euphytica,2017,213:55)。然而，完全将该芥蓝恢复系的油菜遗传背景恢复到回交系的遗传背景仍需经若干世代后才能投入育种实践应用。因此，对于结球甘蓝、花菜、球茎甘蓝等不易抽薹开花的甘蓝类蔬菜来说，基于远缘杂交途径选育出具有育种价值的专用恢复系无疑难度将更大。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一个人工合成的恢复基因RfoB，将含有该基因表达盒的植物表达载体转入甘蓝OguraCMS细胞质不育系后能够实现CMS细胞质雄性不育的育性恢复，将其与其他甘蓝类OguraCMS细胞质不育杂交后也能恢复相应育性，从而在短时间内获得各类甘蓝类蔬菜OguraCMS细胞质不育的专用恢复系。OguraCMS不育恢复基因RfoB，其核苷酸序列是根据萝卜OguraCMS细胞质不育Rfo恢复位点的Rfo基因编码区cDNA序列，结合结球甘蓝(Brassicaoleraceavarcapita)密码子偏好性进行密码子优化而成，所述Rfo基因编码区cDNA序列如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Ogura CMS不育恢复基因RfoB，其核苷酸序列是根据来自萝卜(Raphanus sativus)Ogura CMS细胞质不育Rfo恢复位点的Rfo基因编码区cDNA序列，结合结球甘蓝(Brassica oleracea var capita)密码子偏好性进行密码子优化而成，所述萝卜Ogura CMS细胞质不育Rfo基因编码区cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.OguraCMS不育恢复基因RfoB，其核苷酸序列是根据来自萝卜(Raphanussativus)OguraCMS细胞质不育Rfo恢复位点的Rfo基因编码区cDNA序列，结合结球甘蓝(Brassicaoleraceavarcapita)密码子偏好性进行密码子优化而成，所述萝卜OguraCMS细胞质不育Rfo基因编码区cDNA序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的OguraCMS不育恢复基因RfoB，其特征在于，所述OguraCMS不育恢复基因RfoB的ORF(开放性阅读框)具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的OguraCMS不育恢复基因RfoB，其特征在于，所述恢复基因RfoB自上游密码子(ATG)起第103位处插入有来自马铃薯(Solanumtuberosum)ST-LS1基因的一段内含子序列，所述ST-LS1基因的一段内含子序列如SEQIDNo.3所示，所述恢复基因RfoB的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。4.权利要求1-3任一项所述的OguraCMS不育恢复基因RfoB在制备OguraCMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。5.表达如权利要求1-3任一项所述的OguraCMS不育恢复基因RfoB的植物表达载体，所述植物表达载体含有RfoB表达元件，RfoB表达元件中的启动子是PRfo，PRfo的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。6.如权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述RfoB表达元件中的终止子为E9-t，E9-t的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。7.如权利要求6所述的植物表达载体，其特征在于，所述RfoB表达元件的下游插入有筛选标记基因表达元件，所述筛选标记基因是BAR基因(除草剂草丁膦抗性基因)、NPTII(卡拉霉素抗性基因)或hpt(潮霉素抗性基因)。优选的，所述筛选标记基因是BAR基因。8.如权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因表达元件中的启动子为CaMV35S。9.权利要求5-8任一项所述的植物表达载体在制备OguraCMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。10.权利要求1-3任一项所述的OguraCMS不育恢...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋洪元，杜杨梅，徐冰冰，李勤菲，任雪松，司军，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50