抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。所述的抗重组人bFGF的纳米抗体具有分子量小、特异性强、亲和力高、耐高温等优点；同时，所需剂量低，对黑色素瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可抑制黑色素瘤细胞的生长及迁移。所述的抗人bFGF纳米抗体的制备方法简单，纯化后的纯度可达到90％以上。本发明专利技术为bFGF相关肿瘤疾病的治疗提供新的候选药物，具有良好的应用前景。

Application of anti human bFGF nano antibody in the preparation of drugs for melanoma

The invention discloses the application of anti human bFGF nano antibody in preparing medicine for treating melanoma. The nano-antibody against recombinant human bFGF has the advantages of small molecular weight, strong specificity, high affinity, high temperature resistance, etc. At the same time, the required dose is low, and the proliferation of melanoma cells is obviously inhibited, and the growth and migration of melanoma cells are inhibited. The preparation method of the anti human bFGF nano antibody is simple, and the purity after purification can reach more than 90%. The invention provides a new candidate drug for the treatment of bFGF related tumor diseases, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用
本专利技术属于生物
，特别涉及抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
技术介绍
黑色素瘤是一种恶性程度高的肿瘤，发展迅速，死亡率高，对放疗和化疗均不敏感，除早期原位黑色素瘤可通过外科手术切除，晚期发生转移的黑色素瘤则难以治愈。在一组恶性黑色素瘤细胞系中，研究人员发现每个细胞系都独特的表达bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、PDGF-A、PDGF-B、TGF-β、TGF-α中两种，或者四种、五种细胞因子，但是所有的细胞系都表达bFGF，说明bFGF在黑色素瘤细胞中的表达具有普遍性。从正常上皮非典型性增生，到原位癌早期浸润癌再到已发生转移的恶性黑色素瘤，bFGF在细胞中的表达强度依次升高。研究发现，利用反义核苷酸技术和过量表达突变的FGFR1(FGFR：成纤维细胞生长因子受体)来干扰bFGF通路，能够抑制黑色素瘤细胞的增殖和体内的肿瘤发生，进而说明bFGF是促进黑色素瘤发生和发展的重要影响因子。bFGF/FGFR作为抗肿瘤治疗的靶点之一，目前尚未有商品化的治疗性bFGF抗体，bFGF靶向药物的研发仍有广阔空间。bFGF单抗的抑制肿瘤血管新生和抗肿瘤的作用已经得到了国内外学者的证实和肯定。1987年Massoglia等开创了bFGF单抗研究的先河，1989年Reilly等首次制备出具有中和活性的bFGF单抗，1991年AkiraHori等首次报道bFGF单抗能在特定的条件下抑制肿瘤的生长，1999年Anouma认识到其具有体内外抑瘤活性。国内bFGF单抗的研究始于1998年，向军俭等制备的bFGF单抗能促进细胞增殖，2010年又报道所制备的鼠源性bFGF单抗具有抑制HUVEC血管新生的作用，并且人源性bFGF单抗具有抑制血管新生的作用。虽然目前已有抗bFGF传统抗体和Fab抗体等小分子抗体的相关研究文献和专利报道，但这些报道中所制备的抗体均来自小鼠或兔，为经典的含有重链和轻链的IgG类抗体及其衍生物，没有来自骆驼科动物、只有重链的新型抗体(也就是纳米抗体)的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用；所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含由框架区FR(FrameworkRegion)和互补决定区CDR(Complementarity-determiningRegions)组成的可变区结构域，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，(2)SEQIDNo.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；(3)SEQIDNo.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。所述的可变区结构域包含选自以下任一项的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1所示的CDR1，SEQIDNo.5所示的CDR2和SEQIDNo.9所示的CDR3；(2)SEQIDNo.2所示的CDR1，SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的CDR2，和SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的CDR3；(3)SEQIDNo.3所示的CDR1，SEQIDNo.7所示的CDR2，和SEQIDNo.11所示的CDR3；(4)SEQIDNo.4所示的CDR1，SEQIDNo.8所示的CDR2，和SEQIDNo.12所示的CDR3。所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：(1)SEQIDNo.13～15任一氨基酸序列所示的FR1；(2)SEQIDNo.16～19任一氨基酸序列所示的FR2；(3)SEQIDNo.20～24任一氨基酸序列所示的FR3；(4)SEQIDNo.25～27任一氨基酸序列所示的FR4。所述的抗重组人bFGF的纳米抗体，其氨基酸序列选自如所示的氨基酸序列中的任意一种(SEQIDNO.28～33)；具体如下：所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含与SEQIDNO.28～33所示的任一氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。如SEQIDNO.28～33所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。所述的取代优选为与SEQIDNO.28～33所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。编码如SEQIDNO.28～33所示的氨基酸序列的核苷酸序列依次如SEQIDNO.34～39所示。所述的纳米抗体由342个碱基、336个碱基或369个碱基组成，编码114个氨基酸、112个氨基酸或123个氨基酸，由抗体4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)组成：纳米抗体的CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码19个氨基酸；3个CDR区为特异性序列。所述的药物可为药物组合物，包括药学上可接受的载体。所述的药物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可以包括本专利技术的抗重组人bFGF的纳米抗体联合至少一种其他的抗肿瘤药物。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术提供的抗重组人bFGF的纳米抗体具有分子量小、特异性强、亲和力强、耐高温、对黑色素瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用。因此，本专利技术提供的抗重组人bFGF的纳米抗体可以为bFGF相关肿瘤疾病的治疗提供新的候选药物。附图说明图1是bFGF纳米抗体噬菌体文库3轮淘洗结果图。图2是不同噬菌体抗体克隆的ELISA结果图；其中1为阳性对照，2为阴性对照，3～86分别为不同的噬菌体抗体克隆。图3是bFGF纳米抗体纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2～7是300毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱后得到的纳米抗体，依次为Nb1～Nb6。图4是bFGF纳米抗体与bFGF特异性结合图；其中1为阳性对照(市售鼠抗bFGFIgG抗体，缩写为bFGFmAb)，2～7表示不同的纳米抗体克隆株，依次为Nb1～Nb6。图5是bFGF纳米抗体热稳定实验结果分析图；其中bFGF单抗为阳性对照，Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。图6是bFGF纳米抗体与FGFR2的结合位点研究结果分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。图7是bFGF纳米抗体与bFGF单抗结合位点研究结果分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。图8不同浓度Nb6处理后的黑色素瘤细胞迁移实验结果分析图；其中**表示与bFGF组相比，p<0.01。图9Nb6对不同黑色素瘤细胞Erk1/2和Akt磷酸化水平时间点影响结果分析图；其中**表示与0h组相比，p<0.01。图10是bFGF纳米抗体治疗黑色素瘤瘤体照片图；其中1为阴性对照组，2为抗bFGF纳米抗体组。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含由框架区FR和互补决定区CDR组成的可变区结构域，其特征在于：所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQ ID No.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，(2)SEQ ID No.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；(3)SEQ ID No.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含由框架区FR和互补决定区CDR组成的可变区结构域，其特征在于：所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，(2)SEQIDNo.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；(3)SEQIDNo.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。2.根据权利要求1所述的抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下任一项的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1所示的CDR1，SEQIDNo.5所示的CDR2和SEQIDNo.9所示的CDR3；(2)SEQIDNo.2所示的CDR1，SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示的CDR2，和SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的CDR3；(3)SEQIDNo.3所示的CDR1，SEQIDNo.7所示的CDR2，和SEQIDNo.11所示的CDR3；(4)SEQIDNo.4所示的CDR1，SEQIDNo.8所示的CDR2，和SEQIDNo.12所示的CDR3。3.根据权利要求1所述的抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：(1)SEQIDNo.13～15任一氨基酸序列所示的FR1；(2)SEQIDNo.16～19任一氨基酸序列所示的FR2；(3)SEQIDNo.20～24任一氨基酸序列所示的FR3；(4)SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊盛，谢秋玲，雷云，卢加，李军，洪岸，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44