一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种灵芝80‑3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。获得方法括：(1)提取基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)以切胶纯化产物为模板再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80‑3菌株的专一性。

A specific molecular marker of Ganoderma lucidum 80-3 strain and its obtaining method and Application

The invention relates to a specific molecular marker of Ganoderma lucidum strain 80_3 and its acquisition method and application. The specific primers are used for PCR amplification of Ganoderma lucidum strain, the PCR products are recovered as templates, and another group of specific primers are used for PCR amplification without DNA fragments. The methods were as follows: (1) extract genomic DNA; (2) PCR amplification reaction; (3) PCR amplification products were agarose gel electrophoresis and gelatin purification; (4) PCR was amplified by agarose gel electrophoresis. Compared with conventional morphological detection, antagonistic test and mushroom production test, the invention has the advantages of short detection time, high accuracy and good repeatability, and has the specificity of 80_3 strains among the collected Ganoderma lucidum strains.

【技术实现步骤摘要】
一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
本专利技术属于菌株分子标记
，特别涉及一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用。
技术介绍
灵芝[GanodermaLucidum(Fr.)Karst]隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝属(Ganoderma)，是一种为人熟知的药用真菌。又被称为“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的药用历史。全世界已知的灵芝有100多种，在我国的南北山区均有分布。我国灵芝的人工栽培已经有60多年的历史，野生灵芝的资源十分有限，近年来灵芝的开发越来越受到人们的重视，人工栽培规模越来越大，同时出现了栽培技术和栽培原料的多样化。灵芝的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是灵芝生产的前提和关键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于灵芝可以无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这给菇农和生产企业带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个灵芝产业的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着人工栽培的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证生产。针对目前对于灵芝菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效的菌株鉴定体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性。本专利技术的一种灵芝80-3菌株(保藏编号：CGMCCNO.12879)的特异性分子标记，采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。本专利技术所采用的灵芝80-3菌株(Ganodermalucidum)，保藏单位名称：CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.12879，保藏日期为2016年9月19日。建议分类命名为：灵芝(Ganodermalucidum)。本专利技术的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：(1)提取灵芝80-3菌株的基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；(引物序列基于沪农灵芝1号菌株的pyrF基因前后DNA碱基序列而设计)(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)以切胶纯化产物再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，引物序列为：3F4：CGACTTCGCGTATGACCG；3R4：GGGTCAGAACCATGCGAGTT；(引物序列基于灵芝80-3菌株的pyrF基因的突变位点而设计)。所述步骤(1)中的灵芝80-3菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-3菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的灵芝菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRaExTaq0.5μL，10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。所述步骤(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，在台式紫外仪观察，并割取1414bp左右的条带进行回收。所述步骤(4)以切胶纯化产物再次进行的PCR扩增反应的体系为50μL，包含：TaKaRaExTaq0.5μL，10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。所述步骤(4)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。所述步骤(4)对琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。本专利技术的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别灵芝80-3菌株。本专利技术原理：根据灵芝80-3菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别灵芝80-3菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，对PCR产物回收后以其为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，灵芝80-3再次进行PCR扩增后无DNA片段产生，其它灵芝菌株再次PCR扩增出的DNA片段长度为606bp。有益效果(1)本专利技术方法简单，成本低，对灵芝菌株pyrF基因进行PCR扩增后回收，并再次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，无条带生成即为80-3菌株；(2)本专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本专利技术仅需4天，并且在收集的灵芝菌株中具有80-3菌株的专一性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵芝80‑3菌株的特异性分子标记，其特征在于：采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。

【技术特征摘要】
1.一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记，其特征在于：采用特异性引物对灵芝菌株进行PCR扩增，回收PCR产物作为模板，再以另一组特异引物进行PCR扩增，无DNA片段产生。2.一种如权利要求1所述的灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：(1)提取灵芝80-3菌株的基因组DNA；(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：L2F4：CCTAGCCCAACTGCACAAGA；L2R4：CGTGAGTTTAGCCACCGGAT；(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化；(4)以切胶纯化产物为模板再次进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，引物序列为：3F4：CGACTTCGCGTATGACCG；3R4：GGGTCAGAACCATGCGAGTT。3.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中的灵芝80-3菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将灵芝80-3菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。4.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRaExTaq0.5μL，10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。5.根据权利要求2所述的一种灵芝80-3菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的P...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍大鹏，万佳宁，卢绪志，周陈力，茅文俊，唐传红，吴莹莹，杨瑞恒，李燕，王莹，汪滢，唐利华，高英女，龚明，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31