巢式PCR快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物及其应用，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.4所示。采用本发明专利技术提供的方法和试剂盒，可以检测特定材料是否被核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌侵染，也可以针对核桃种植区进行核桃炭疽病危害的预警，防治核桃炭疽病大面积传播造成的农业经济损失。本发明专利技术的方法及试剂盒具有快速高效，易于实现，敏感可靠等优点，可在一天内完成多个待考察地区的检测或预警。

Establishment and application of nested PCR for rapid detection of Colletotrichum anthracis

The present invention discloses a specific primer for nested PCR detection of Colletotrichum gloeosporioides, a pathogenic bacterium of walnut anthracnose, and its application. It consists of a first primer pair and a second primer pair. The upstream primer sequence of the first primer pair is shown as SEQ ID No.1, and the downstream primer sequence of the first primer pair is shown as SEQ ID No.2. The upstream primer sequence of the second primer pair is shown in SEQ ID No.3 and the downstream primer sequence of the second primer pair is shown in SEQ ID No.4. The method and the reagent kit provided by the invention can detect whether a specific material is infected by colloidal anthracnose, the pathogen of walnut anthracnose, and can also warn the damage of walnut Anthracnose in the walnut planting area to prevent and control the agricultural economic losses caused by the large-scale spread of walnut anthracnose. The method and the reagent kit of the invention have the advantages of high speed, high efficiency, easy realization, sensitivity and reliability, and can complete the detection or early warning of multiple areas to be investigated in one day.

【技术实现步骤摘要】
巢式PCR快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物及应用。
技术介绍
随着核桃集约栽培程度的不断提高和种植面积扩大，传统的粗放管理模式及不适宜品种的选择导致核桃病害危害日趋严重，已成为核桃产业发展面临的严峻问题，其中炭疽病是近年来危害核桃产业的主要病害，在核桃上主要危害果实，引起早期落果或核桃不成实，发病重的年份可致丰产不丰收，而且感染叶片、嫩梢，病害连片，造成叶片、嫩梢大面积坏死。核桃炭疽病的病原菌为胶胞炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)，属半知菌亚门、腔孢纲、炭疽菌属。该病原菌在病枝、病果或土壤中越冬，翌年春季病原菌开始活动并借风、雨、昆虫传播。发病轻重与降雨密切相关，雨季早且降雨量大则病害发病早且严重，此外，水位高、株行间距小、通风透光不良也易造成病害发病严重和传播蔓延。由于该病具有潜伏侵染的特性，且具有发病时间集中、爆发性强等特点，故选择化学药剂进行防治仍是当前主要对策，但发病后再进行防治，往往对核桃产量已造成较重影响。因此亟需一种能够在发病初期进行早期快速检测的技术，为及时有效的防控措施提供指导。传统的植物病害的诊断主要依据植株的明显病症和病原菌形态，操作难度大，耗时耗力，且此时病害往往已对植株造成危害，因此亟需快速而准确的检测技术应用于植物病害的诊断过程中。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种快速而准确的检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的手段。本专利技术的技术方案为：用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQIDNo.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQIDNo.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQIDNo.4所示。上述所述的特异性引物在巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌上的应用。一种巢式PCR试剂盒，含上述所述的特异性引物。一种检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的方法，包括如下步骤：(1)采取待测的样品，并提取总DNA；(2)以总DNA为模板使用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的引物对进行第一轮PCR扩增；(3)取第一轮PCR扩增产物为模板使用SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的引物对进行第二轮PCR扩增；(4)结果判断：检测第二轮PCR扩增产物，结果出现302bp特征条带说明所述样品具有了核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌；未出现302bp特征条带说明所述样品未具有核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌。进一步地，上述所述的方法中，所述第一轮PCR扩增体系如下：扩增体系：TaqDNA聚合酶12.5ul，SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示引物各1ul，DNA模板1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；PCR扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55s，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min，终止温度为4℃；所述第二轮PCR扩增体系如下：扩增体系：TaqDNA聚合酶12.5ul，SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示引物各1ul，第一轮PCR扩增产物1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；PCR扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，69℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min，终止温度为4℃。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术方法具有操作简便，灵敏度高，特异性强，检测速度快等特点，可被广泛应用于核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的检测，本方法针对核桃炭疽病致病菌进行检测，提供了该致病菌快速、高灵敏度的检测方法和体系。本专利技术检测方法与传统的核桃炭疽病病害的诊断方法以及常规PCR相比，具有准确性高，特异性、灵敏度和重复性好等特点。本专利技术检测时间只要6小时左右，每检测一个样品只需要一个叶片，只需一个人就可以完成对多个地区的样品检测；而传统的核桃炭疽病病害的诊断方法耗时耗力，预警性差，常规PCR检测虽然检测时间短，但灵敏度、准确性较巢式PCR差。附图说明图1为四川农业大学林学院森林保护病理实验室从四川、陕西、湖北等地采集的疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织以及患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织特异性检测结果电泳图；泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1-8为疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织；泳道9-23为患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织；泳道N：阴性对照；图2为采集于四川农业大学崇州基地的有典型炭疽病病症核桃枝叶组织和发病初期无明显病症的核桃枝叶组织检测结果电泳图，健康核桃枝叶组织为阴性对照；泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1为具有典型炭疽病病症核桃枝叶组织；泳道2为发病初期无明显病症的核桃枝叶组织；泳道3为健康核桃枝叶组织。具体实施方式下面通过具体实施方式详细描述来进一步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限制，仅仅作示例说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常用生化试剂商店够买所得，特异性引物委托成都擎科生物技术有限公司合成。生物材料来源表1生物材料获取来源：以下材料采集自四川农业大学崇州基地：人工接种有典型炭疽病病症核桃枝叶组织人工接种发病初期无明显病症的核桃枝叶组织健康核桃枝叶组织实施例1用于核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物序列设计步骤一、序列获得1、通过NCBI的GENBANK数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索所有已报道、已发现、已提交数据库的炭疽属不同种的ITS序列；2、将尽可能多的炭疽属不同种的ITS序列下载后，使用DNAMAN软件进行序列比对分析；3、通过DNAMAN软件进行多重同源性比较，根据比对结果选取序列差异位点；步骤二、方法：使用PRIMER6，OLIGO引物设计软件根据差异位点设计引物。步骤三、引物设计原则：1、两引物中G+C碱基对的百分比尽量相似；2、引物内部避免具有明显的二级结构；3、两引物之间不应有互补序列，避免形成“引物二聚体”；4、引物与靶DNA片段的配对须精确、严格，尤其3’末端；5、特异引物应具有一定的退火温度(不低于50℃)和一定的长度(不少于18个bp)。步骤四、结果：在NCBIGenBankdatabase(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)内使用BLASTn初步验证引物的特异性。本专利技术获得的引物对序列如下：第一轮引物对：上游引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQIDNo.1)；下游引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQIDNo.2)；第二轮引物对：上游引物YH1:5’-TCCCGCCTCCGGGCGGGTCG-3’(SEQIDNo.3)；下游引物YH2:5’-TTTGAGGGCCTACATCAGC-3’(SEQIDNo.4)。该引物扩增的条带清晰，扩增结果稳定，重复性好。实施例2验证PCR引物在检测核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物，其特征在于，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物，其特征在于，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如SEQIDNo.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如SEQIDNo.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如SEQIDNo.4所示。2.根据权利要求1所述的用于巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的引物在巢式PCR检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌上的应用。3.一种巢式PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。4.一种检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采取待测的样品，并提取总DNA；(2)以总DNA为模板使用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的引物对进行第一轮PCR扩增；(3)取第一轮PCR扩增产物为模板使用SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的引物对进行第二轮PCR扩增；(4)结果判断：检测第二轮PCR扩增产物，结...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩珊，余鹏举，朱天辉，万雪琴，刘应高，谯天敏，李姝江，王若梅，张博阳，李鸿鹏，黄焱焱，阮若玉，汪昱伶，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51