用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法。引起幼畜腹泻的产肠毒素大肠杆菌常带有F4、F5、F6、F18和F41菌毛及其编码基因，本发明专利技术通过对5种菌毛基因序列的比对分析，设计并合成了一套特异性检测引物组，并建立了一种用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR检测方法，组装了一个含有特异性引物组的试剂盒。使用本发明专利技术的试剂盒检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因具有特异性强，快速简单，灵敏度好等优点，适用于快速检测从病畜腹泻样品中分离的大肠杆菌的菌毛基因，是筛选和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛血清型的有效技术手段。

【技术实现步骤摘要】
用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测产肠毒素大肠杆菌菌毛基因的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法，特别涉及用于检测产肠毒素大肠杆菌F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的多重PCR引物组、试剂盒及检测方法。本专利技术属于生物检测

技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)为革兰阴性无芽孢短杆菌，自1885年被发现后一直被当作正常肠道菌群的组成部分，是非致病菌。直到20世纪中叶，研究发现一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物，尤其对婴儿和幼龄动物有致病性，常引起严重腹泻和败血症。目前致病性大肠杆菌可分为产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、黏附和损伤性大肠杆菌(AEEC)、广泛黏附性大肠杆菌(DAEC)、败血性大肠杆菌(SEPEC)、禽致病性大肠杆菌(APEC)和尿道致病性大肠杆菌(UPEC)。其中ETEC是导致幼畜腹泻的主要病原菌之一，可引起仔猪白痢、仔猪黄痢、犊牛白痢等腹泻性疾病，严重者脱水，死亡，给养殖业造成巨大经济损失。调查发现，引起幼畜腹泻的ETEC常带有不同类型的菌毛，并借助菌毛的黏附作用定居在肠绒毛上皮细胞，分泌肠毒素产生致病作用。ETEC常见的菌毛有F4、F5、F6、F41、F18，因此对编码这些菌毛的基因的快速检测有助于对大肠杆菌分离菌的致病性、菌毛血清型快速鉴定和疾病的快速诊断。ETEC多经消化道感染，其中新生幼畜及婴幼儿易感性最高。据调查，ETEC引起新生幼畜腹泻所占的比例，猪为35％，牛为26％，羊为17％。目前我国针对ETEC相关菌毛的检测方法主要以传统检测方法为主，具体操作流程是在分离培养的基础上用菌毛单因子血清进行玻板凝集试验检测菌毛或用PCR方法检测菌毛编码基因。由于PCR技术的广泛应用，菌毛单因子血清产品越来越少，玻板凝集试验受到限制。目前国内虽有检测大肠杆菌菌毛基因的单一PCR和多重PCR方法，但最多同时只能检测4种(F4、F5、F6、F41)菌毛基因，而针对F4、F5、F6、F41、F185种菌毛基因的多重PCR方法还未见报道，因此，本专利技术建立了一种多重PCR检测方法，该方法能够实现上述5种菌毛基因的同时检测，适用于ETEC菌毛血清型鉴定和幼畜腹泻病的诊断，可推广应用。多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上的引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增。该方法可在同一个反应体系中对多个菌毛基因进行检测，省去了使用多种单因子血清或PCR方法对分离菌多次检测的步骤，具有简单、灵敏度高、特异性好的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测产肠毒素大肠杆菌F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的检测引物组、试剂盒及多重PCR检测方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组，包括用于检测大肠杆菌F4(K88)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F5(K99)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F6(987P)菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F41菌毛基因的引物对和用于检测大肠杆菌F18菌毛基因的引物对，其中：所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F4菌毛基因的引物对为：F1：5’-ATTTCAATGGTTCGGTCG-3’(SEQIDNO.1所示)R1：5’-GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG-3’(SEQIDNO.2所示)所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的引物对为：F2：5’-AAACACTGCTAGCTATTATC-3’(SEQIDNO.3所示)R2：5’-ATAAGTGACTAAGAAGGATGC-3’(SEQIDNO.4所示)所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F6菌毛基因的引物对为：F3：5’-ACTTCTAATCTGTCGCAAACC-3’(SEQIDNO.5所示)R3：5’-GAACGAATAGTCATTACTGCAC-3’(SEQIDNO.6所示)所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛基因的引物对为：F4：5’-ATCAGCGGCAGTATCTGGTT-3’(SEQIDNO.7所示)R4：5’-GAGGTCATCCCAATTGTG-3’(SEQIDNO.8所示)所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F18菌毛基因的引物对为：F5：5’-GGTGATGATGATTAGTGATGTG-3’(SEQIDNO.9所示)R5：5’-TGTTGCCCCCACTGAGA-3’(SEQIDNO.10所示)。进一步的，本专利技术还提出了所述的多重PCR引物组在制备检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的试剂或试剂盒中的用途。以及所述的多重PCR引物组在制备产肠毒素大肠杆菌菌毛血清型鉴定的试剂或试剂盒中的用途。其中，优选的，所述的产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因包括大肠杆菌F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因。更进一步的，本专利技术还提出了一种用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术以上所述的引物组。使用所述的试剂盒检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因时，包括如下步骤：(1)提取待检样品DNA；(2)利用权利1要求所述的引物组进行多重PCR扩增反应；(3)根据PCR产物判断待检样品中是否含有5种菌毛基因。其中，优选的，所述多重PCR扩增反应体系的组成如下所示：其中，所述多重PCR扩增反应的参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存产物。其特异性扩增产物电泳后出现769bp条带为大肠杆菌F4菌毛基因，出现532bp条带为大肠杆菌F5菌毛基因，出现421bp条带为大肠杆菌F6菌毛基因，出现642bp条带为大肠杆菌F41菌毛基因，出现1139bp为大肠杆菌F18菌毛基因。本专利技术分别以产肠毒素大肠杆菌参考菌株C83903(F4+)、C83199(F5+)、C83915(F6+)、C83920(F5+、F41+)、C83684(F18+)、大肠杆菌分离菌DN48A(无菌毛)、DN67A(无菌毛)、绿脓杆菌51-B、巴氏杆菌CVCC430、猪丹毒杆菌CVCC124、猪霍乱沙门氏菌CVCC503的基因组进行实验，以验证该方法的特异性。结果显示，本专利技术方法能够对产肠毒素大肠杆菌的参考菌株进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本专利技术方法具有较强特异性。取5种过夜培养的新鲜菌液等量混合后，进行10倍梯度稀释，从每个稀释度产肠毒素大肠杆菌混合菌液中各取2.5μL，作为模板进行PCR检测。同时，分别取各稀释度的菌液100μL均匀涂布于LB琼脂平板上，置于37℃温箱培养10h，菌落计数。结果表明，该多重PCR方法同时检测5种产肠毒素大肠杆菌菌毛基因的最小检出量为：F49×104CFU/mL；F59×104CFU/mL；F69×105CFU/mL；F419×104CFU/mL；F189×104CFU/mL。相较于现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组包括用于检测大肠杆菌F4菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F5菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F6菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F41菌毛基因的引物对和用于检测大肠杆菌F18菌毛基因的引物对，其中：所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F4菌毛基因的引物对为：F1：5’‑ATTTCAATGGTTCGGTCG‑3’R1：5’‑GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG‑3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的引物对为：F2：5’‑AAACACTGCTAGCTATTATC‑3’R2：5’‑ATAAGTGACTAAGAAGGATGC‑3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F6菌毛基因的引物对为：F3：5’‑ACTTCTAATCTGTCGCAAACC‑3’R3：5’‑GAACGAATAGTCATTACTGCAC‑3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛基因的引物对为：F4：5’‑ATCAGCGGCAGTATCTGGTT‑3’R4：5’‑GAGGTCATCCCAATTGTG‑3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F18菌毛基因的引物对为：F5：5’‑GGTGATGATGATTAGTGATGTG‑3’R5：5’‑TGTTGCCCCCACTGAGA‑3’。...

【技术特征摘要】
1.用于检测产肠毒素大肠杆菌5种菌毛基因的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组包括用于检测大肠杆菌F4菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F5菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F6菌毛基因的引物对、用于检测大肠杆菌F41菌毛基因的引物对和用于检测大肠杆菌F18菌毛基因的引物对，其中：所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F4菌毛基因的引物对为：F1：5’-ATTTCAATGGTTCGGTCG-3’R1：5’-GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG-3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的引物对为：F2：5’-AAACACTGCTAGCTATTATC-3’R2：5’-ATAAGTGACTAAGAAGGATGC-3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F6菌毛基因的引物对为：F3：5’-ACTTCTAATCTGTCGCAAACC-3’R3：5’-GAACGAATAGTCATTACTGCAC-3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛基因的引物对为：F4：5’-ATCAGCGGCAGTATCTGGTT-3’R4：5’-GAGGTCATCCCAATTGTG-3’所述的用于检测产肠毒素大肠杆菌F18菌毛基因的引物对为：F5：5’-GGTGATGATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：师东方，孙思萌，董秀梅，张萍，朱妍，苏瑞红，唐毓，侯美佳，冯启峥，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23