一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法技术

本申请公开了一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法，包括以下步骤：a、大肠埃希菌悬液中加入CaCO3，SDS，NaOH，28‑40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入H2O2及缓冲液，28‑40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；d、将菌影重悬液、质粒、CaCl2混合，1‑10℃孵育，然后30‑50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。本发明专利技术提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载DNA质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法
本申请涉及免疫学
，特别是涉及一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法。
技术介绍
菌影(bacterialghosts，BGs)也称为菌蜕，是一类去除了细菌胞浆内容物而保留其完整外壳的革兰氏阴性菌。由于菌影保存了天然细菌的细胞壁、菌毛、鞭毛等结构以及活菌的固有形态，能有效诱导特异性免疫应答，并能大量装载DNA质粒，是近年来发现的一种理想的DNA递送系统和疫苗佐剂，被广泛用于沙眼衣原体、HIV、幽门螺杆菌等多种病原体的疫苗研究。理论上所有革兰阴性菌都可作为菌影，目前以大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)菌影(EBG)最常用。目前制备菌影用于DNA质粒装载的方法，通常是先用基因温控法制备菌影，再用悬浮法装载DNA质粒。基因裂解温控法制备菌影，是将含有噬菌体PhiX174裂解基因E和温控元件的质粒转化入革兰氏阴性菌，然后在较高温度(通常为39～42℃)通过热诱导激活裂解基因E，表达裂解蛋白，该裂解蛋白通过与细菌内膜或外膜融合，在多种革兰氏阴性细菌细胞膜和细胞壁上形成特异性跨膜孔道，包括核酸、核糖体在内的所有细胞质成分从跨膜通道流出，剩下的细菌空壳即为菌影。制备的菌影采用悬浮法装载质粒，该方法先将菌影冻干成干粉状，然后重悬在含有高浓度的DNA质粒溶液中，再洗去未结合的DNA质粒。采用基因裂解温控法制备菌影，存在以下缺点：①仅限于革兰氏阴性菌菌影制备；②短时间内很难达到100％菌影裂解，存在潜在的危险；③操作需要多步骤，成本高且费时；④制备时对细菌的光密度(OD)要求严格，当OD值大于0.5细菌会持续生长，不裂解为菌影，而当OD值小于0.5时，菌会全部裂解而无法获得菌影；⑤只能用少量菌获得菌影，无法放大生产。而采用悬浮法装载DNA质粒的过程中，需要将菌影冻干成粉末才可有效装载，受冻干条件限制，制备费时。因此，如何实现菌影的制备及DNA质粒的有效装载，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的为提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法；本专利技术提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载DNA质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。本专利技术提供的技术方案如下：一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法，包括以下步骤：a、大肠埃希菌悬液中加入CaCO3，SDS，NaOH，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入H2O2及缓冲液，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；d、将菌影重悬液、质粒、CaCl2混合，1-10℃孵育，然后30-50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。优选地，所述步骤a中，加入的CaCO3终浓度为0.01-1mg/L，加入的SDS终浓度为100-500mg/L，加入的NaOH终浓度为10-100mg/L。优选地，所述步骤b中，加入的H2O2具体为5％-30％的H2O2；和/或，所述步骤c中，加入的乙醇具体为55％-75％的乙醇。优选地，所述步骤a中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.5-10h；和/或，所述步骤b中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.1-30min。优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，洗涤具体为：使用缓冲液将沉淀重悬后，离心，收集沉淀；洗涤次数为1-3次。优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，所述离心具体为：1000-5000rpm离心3-30min；所述步骤d中，所述离心具体为：8000-15000rpm离心1-10min。优选地，所述步骤c中，加入乙醇后，静置反应3-30min，并每隔1-5min轻微震动一次。优选地，所述步骤d中，孵育温度为4-8℃，孵育时间为10-60h；和/或，所述热激活处理的温度为40-45℃，热激活处理的时间为30-240s。优选地，所述步骤d中，使用的CaCl2的终浓度为2000-3000mg/L；和/或，所述质粒的终浓度为100-200mg/L，所述菌影的终浓度为1000-8000mg/L。优选地，所述步骤d中，冰浴反应时间为1-10min。本专利技术针对现有技术存在的不足，提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法，使用化学渗透压法制备大肠埃希菌菌影，然后使用氯化钙法实现对菌影进行DNA质粒的装载。本专利技术提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载DNA质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。具体而言，首先利用化学渗透压法将大肠埃希菌制成菌影，利用CaCO3，SDS(十二烷基磺酸钠)，NaOH的共同作用，可以在形成渗透压的同时使细菌壁保持完整。然后依次使用H2O2、乙醇进行灭活，可完全灭活细菌，得到获得100％裂解的菌影，无安全风险。相较于基因裂解温控法操作步骤多，成本高(需要有带裂解基因E和温控元件的质粒，该质粒不可商品化购买)且费时的缺点，本专利技术中，只需用低成本的常规化学试剂(NaOH、SDS、CaCO3、H2O2、乙醇)在适宜的浓度和温度的条件下即可高效获得菌影，且批次间稳定，可量产。然后，将得到的菌影与目标DNA质粒、氯化钙混合，通过低温孵育、热激活处理、冰浴等步骤，制备装载有DNA质粒的大肠埃希菌菌影。相较于悬浮法装载质粒，需要将菌影冻干，操作繁琐的缺点，本专利技术中，使用化学渗透压法制备的菌影，不具备基因裂解温控法形成特异性跨膜通道，因此，本专利技术采用氯化钙法对化学渗透压法制备的菌影进行DNA装载，利用低渗氯化钙在低温下使细胞膨胀，并与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。迅速在40-45℃下做短暂的热刺激后，复合物便会被细胞所吸收，从而实现装载。本专利技术采用氯化钙法装载质粒，方法简便，装载DNA的效率(80.65％)并不低于常规方法(基因裂解温控法结合悬浮法)装载的效率。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例中化学渗透法得到的菌影的透射电镜鉴定图一；图2为本专利技术实施例中化学渗透法得到的菌影的透射电镜鉴定图二；图3为本专利技术实施例中未处理组的透射电镜鉴定图；图4为本专利技术实施例中菌影DNA的电泳鉴定图；图5为本专利技术实施例中化学渗透压法菌影作用时间-菌影产率关系图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。请如图1至图5所示，本专利技术实施例提供一种制备大肠埃希菌菌影并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、大肠埃希菌悬液中加入CaCO3，SDS，NaOH，28‑40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入H2O2及缓冲液，28‑40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；d、将菌影重悬液、质粒、CaCl2混合，1‑10℃孵育，然后30‑50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。

【技术特征摘要】
1.一种制备大肠埃希菌菌影并装载DNA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、大肠埃希菌悬液中加入CaCO3，SDS，NaOH，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入H2O2及缓冲液，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；d、将菌影重悬液、质粒、CaCl2混合，1-10℃孵育，然后30-50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中，加入的CaCO3终浓度为0.01-1mg/L，加入的SDS终浓度为100-500mg/L，加入的NaOH终浓度为10-100mg/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，加入的H2O2具体为5％-30％的H2O2；和/或，所述步骤c中，加入的乙醇具体为55％-75％的乙醇。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤a中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.5-10h；和/或，所述步骤b中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾铁兵，江银波，凌晖，曹龙古，曹二龙，符波，唐一之，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43