微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法。微流体装置包括多个反应孔和多个固体支持体，并且每一个固体支持体具有附接至其上的试剂。所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解。

【技术实现步骤摘要】
微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法本申请为分案申请，原申请的申请日为2013年3月15日，申请号为201380039315.0(PCT/US2013/032300)，专利技术名称为“微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法”。相关申请本申请要求提交于2012年5月25日的美国临时申请系列号61/651,648的优先权，该申请的公开内容通过整体引用而并入此处。专利
本专利技术涉及微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法。背景聚合酶链反应(PCR)是用于扩增基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)的区段的高灵敏性方法。PCR具有许多应用，例如：检测痕量核酸以确定存在致病生物体、基因表达、基因分型、遗传工程或修饰和法医的科学应用。PCR扩增提供在大范围的分析物浓度中卓越的靶标鉴定和定量。然而，经PCR同时且定量地分析许多分析物已经被证明是极富挑战性的。基于嵌入染料荧光的检测仅能确定总dsDNA的浓度，因此在单一反应器中并行分析多个模板不可能使用此检测方法。荧光探针技术(即，Taqman、分子信标或其他化学法)可用于低水平的反应多重化，因为每种靶标可使用不同颜色的荧光探针作为信号报告分子来扩增。探针也是序列特异性的，降低源自引物二聚体形成或非特异性扩增的假阳性。用常规微量滴定板或微流体实时-PCR(rt-PCR)进行多重化的典型方法是使用少量的反应孔，每孔含有三种不同颜色的探针。然而，通常认为设计多重化的引物和探针集合是有挑战性的，因为它们需要附加水平的小心设计和优化以确保彼此的兼容性。依据此方法的多重化因染料之间的光谱重叠和仪器而最终限于四色检测，而一种颜色通常预留为内标染料。多重化PCR的优化挑战也对新出现的疾病的测定或需要分析新序列的其他时间敏感性应用的快速重构产生障碍。在多重化PCR中遇到的其他难题包括：产生二聚体的引物互补性、外来的DNA与扩增子或引物/探针之间的非特异性相互作用，以及其中短序列与较长序列相比扩增更快的固有偏倚。此外，虽然使用在少量的反应孔中分隔开的多重化反应可对在诸如GeneXpert(Cepheid)或JBAIDS(IdahoTechnologyInc.)等系统中的少量靶标(约3-12个)运行良好，但此方法对于显著较大量的靶标变得不方便。在护理点或制造点，与这些技术一起使用的盒(cartridge)必须单个地装载相对大量的液体试剂。诸如来自LifeTechnologies的OpenArrayReal-TimePCRSystem等技术使用在大约3000个微孔的阵列中干燥的预装引物/探针序列。此技术不进行样品清除或制备，并且它需要多件单独的仪器以加工、装载和分析样品。此外，预装引物/探针集合必须使用基于印制的技术来完成，所述技术极大地增加装置制作所需的时间和花费。专利技术实施方案概要在一些实施方案中，微流体装置包括多个反应孔和多个固体支持体。每一个固体支持体具有附接至其上的试剂，其中所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解。在一些实施方案中，裂解操作包括热力操作、添加化学品和/或应用光至试剂/支持体键。试剂可包括用于PCR反应的引物。不稳定的试剂/支持体键可包括链霉亲和素-生物素键和/或抗生物素蛋白-生物素键。裂解操作可包括热力操作。在一些实施方案中，将链霉亲和素-生物素键配置用以当固体支持体在约50-99℃下孵育时从支持体释放试剂。固体支持体可为微珠例如磁性微球。在一些实施方案中，固体支持体包含标记。标记可包含预定支持体形状、预定支持体大小、支持体的磁性特性和/或光学特性。标记可包括荧光标记。在一些实施方案中，将所述多个孔和所述多个固体支持体调整大小并配置使得仅单个所述多个固体支持体容纳于对应的单个所述多个孔中。所述多个孔可包含固体支持体容纳区域或固体支持体容纳区域和反应区，并且可将该固体支持体容纳区域配置用以容纳单个所述多个固体支持体。固体支持体容纳区域可具有与单个所述多个固体支持体的大小和/或形状基本对应的横截面积。在一些实施方案中，反应可发生或启始于固体支持体容纳区域中，其可在此情况下充当反应区。反应区可具有比固体支持体容纳区域的横截面积更大的横截面积。微流体装置可包含密封件(弹性膜，例如聚二甲基硅氧烷)或以流体性隔离各个所述多个孔的不可混溶的流体。微流体装置可包含在孔中的膜。膜可为提取膜。在一些实施方案中，膜包含单片氧化铝膜。在一些实施方案中，通道连接至膜，所述膜配置用以提供通过膜与所述多个孔的流体连接。在一些实施方案中，将孔配置以容纳多个支持体。在一些实施方案中，图案化的微柱在膜和通道之间以支撑膜，但允许来自所述多个孔的经由膜的均匀流体流动。在一些实施方案中，将试剂配置用以从所述多个孔之一中的多个珠上释放而实现试剂之间的反应。在一些实施方案中，用于向包含多个反应孔的微流体装置提供试剂的方法包括提供在所述多个反应孔中的多个固体支持体，每个固体支持体具有附接至其上的试剂使得该试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体并且将该试剂配置以通过裂解操作而从支持体裂解。进行裂解操作以释放试剂到所述多个反应孔内的溶液中。附图简述结合入并组成说明书的一部分的附图阐释本专利技术实施方案，并且和说明一起用以解释本专利技术的原理。图1A为依据一些实施方案的具有引物附接至其上的珠的示图。图1B为依据一些实施方案的具有不同编码特性的四个珠的示图。图2为具有用于保持图1A-1B的珠/引物的多个孔的微流体装置的数字图像。图3为图2的微流体装置的侧视截面图。图4为展示测得的DNA量(ng/μL)并指示在室温和95℃下从珠上释放的引物的量和不含引物珠的样品的条线图。图5A-5D为阐释依据一些实施方案的配置用以在各自孔中容纳各个珠的微流体的示图。图6为展示依据一些实施方案的使用三种不同珠集合对三种不同模板序列的PCR扩增的数据的线图。图7为依据一些实施方案的数字荧光显微术图像，其展示：来自含有扩增模板分子的图2-3装置的孔的嵌入染料的相对强的信号，和来自图像中央的空白反应孔的几乎没有的信号。图8为依据一些实施方案的针对rt-PCR实验的PCR循环数绘制的图2-3装置中各孔的荧光信号的图。图9为依据一些实施方案的微流体装置示意图。图10为图9的装置的透视图，其展示基底的对齐.图11为图9装置的侧视截面图。图12为示意图的顶视图，其展示了依据一些实施方案的具有光刻胶道以控制流体流动的微流体装置。图13为图12的装置的光学显微术图像，其展示其中金层被除去的100μm×100μm的垫。珠孔位于孔中央。图14为在图12的装置中的444个垫上隔离的染料溶液的荧光图像。未看到桥接和看到很少的偏离的小液滴。图15A-15B为带有440个亲水反应区(100μm×100μm孔)的依据一些实施方案的微流体装置的荧光图像，所述反应区使用25μm高的光刻胶隔离物隔离250pL(图15A)和使用7.5μm隔离物隔离75pL(图15B)。图15C为依据一些实施方案的微流体装置的荧光图像其包括1500个用9μm隔离物隔离出22.5pL体积的反应区(50μm×50μm孔)图16A-16C为依据一些实施方案的微流体装置中的数字PCR反应的荧光图像，其展示用每个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微流体装置，其包含：多个反应孔；多个固体支持体，每一个固体支持体具有附接至其上的试剂，其中所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解，其中将所述孔配置以容纳两个或更多个所述多个支持体。

【技术特征摘要】
2012.05.25 US 61/6516481.一种微流体装置，其包含：多个反应孔；多个固体支持体，每一个固体支持体具有附接至其上的试剂，其中所述试剂通过不稳定的试剂/支持体键而附接至固体支持体以便将所述试剂配置以通过裂解操作而从支持体上裂解，其中将所述孔配置以容纳两个或更多个所述多个支持体。2.权利要求1的微流体装置，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的所述两个或更多个所述多个支持体释放而实现试剂之间的反应。3.权利要求2的微流体装置，其中将所述试剂配置以从所述多个孔之一中的多个珠释放且为设计以实现从较小的化学单位形成较大的分子的“点击化学”试剂。4.权利要求1的微流体装置，其中所述裂解操作包括：热力操作、添加化学品、添加酶、应用电势和/或应用光和/或电离辐射至试剂/支持体键。5.权利要求4的微流体装置，其中所述试剂包含用于核酸转录和/或扩增反应的核酸序列。6.权利要求5的微流体装置，其中所述试剂包含用于PCR反应的DNA引物或探针。7.权利要求6的微流体装置，其中所述不稳定的试剂/支持体键包含链霉亲和素-生物素键和/或抗生物素蛋白-生物素键。8.权利要求7的微流体装置，其中所述裂解操作包含热力操作。9.权利要求8的微流体装置，其中将所述链霉亲和素-生物素键配置用以当在约50-99℃下孵育固体支持体时从支持体上释放试剂。10.权利要求1-9中任一项的微流体装置，其中所述固体支持体为微珠。11.权利要求10的微流体装置，其中所述微珠为磁性的。12.权利要求10或11中任一项的微流体装置，其中所述固体支持体包含配置以鉴别固体支持体和/或试剂的特性的标记。13.权利要求12的微流体装置，其中所述标记包括预定的支持体形状、预定的支持体大小、支持体的磁性性质和/或光学性质。14.权利要求12的微流体装置，其中所述标记包括荧光标记。15.权利要求10-14中任一项的微流体装置，其中所述微流体装置包含密封件(弹性膜，例如聚二甲基硅氧烷)或不可混溶的流体以流体性隔离各个所述多个孔。16.任何前述权利要求中任一项的微流体装置，其中所述微流体装置在孔中包括膜。17.权利要求16的微流体装置，其中所述膜包括提取膜。18.权利要求17的微流体装置，其中所述膜包括单片氧化铝膜。19.权利要求16-18中任一项的微流体装置，其另外包括连接至膜的通道，其配置用以提供通过膜与所述多个孔的流体连接。20.权利要求16-19中任一项的微流体装置，其另外包括在膜和通道之间图案化的微柱以支撑膜但允许来自所述多个孔的经由膜的均匀流体流动。21...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM拉姆齐，W亨利，E奥布拉思，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，
类型：发明
国别省市：美国,US