对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针技术

本发明专利技术的一个实施方式为对目标核酸进行检测的核酸探针。目标核酸的探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离该鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域存在1个以上的胞嘧啶碱基。核酸探针与目标核酸的探针结合区域杂交。核酸探针具备末端具有与该鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合于该胞嘧啶碱基的荧光色素。该荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素。所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸完全互补，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针
本专利技术涉及对目标核酸进行检测的方法及该方法中使用的核酸探针。
技术介绍
作为核酸的检测方法之一，可举出荧光标记探针法(参照下述专利文献1)。该方法中使用的探针例如有具备荧光色素及具有使荧光色素产生的荧光消光的作用(也称作“消光作用”)的消光分子按照相邻的方式结合的单链寡核苷酸的核酸探针。该核酸探针是按照与作为目标的核酸(以下称作“目标核酸”)杂交的方式设计的。在聚合酶链反应(以下也称作“PCR”)中，当上述核酸探针与目标核酸杂交、进而核酸探针被具有核酸酶活性的聚合酶分解时，消光分子会自荧光色素离去，因此荧光色素的荧光强度增加。在使用上述具有单链寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过核酸探针分解前后的荧光强度或荧光波长的变化，对目标核酸进行检测。在荧光标记探针法使用的探针中有具有长度不同的2条寡核苷酸的核酸探针(参照下述专利文献2-3)。该核酸探针中，2条寡核苷酸具有相互间互补的碱基序列，将荧光色素结合在一条寡核苷酸上、将具有使荧光色素产生的荧光消光的作用的消光分子结合在另一条寡核苷酸上。PCR中，在加热至高温时，上述2条寡核苷酸分离。与其相伴，消光分子自荧光色素离去，因此荧光强度增加。接着，当降低温度时，较长的寡核苷酸与目标核酸杂交，持续观测到荧光色素产生的荧光。另一方面，在不存在目标核酸的情况下，当降低温度时，上述2条寡核苷酸相互间杂交，消光分子靠近荧光色素，因此荧光色素产生的荧光发生消光。在使用具有上述2条寡核苷酸的核酸探针的方法中，通过测定PCR退火阶段的荧光强度，对目标核酸进行检测。荧光标记探针法中使用的探针中，还有被靠近鸟嘌呤碱基时、荧光强度减少的(也称作“消光”)荧光色素标记的QuenchingProbe(以下称作“QProbe”)(参照下述专利文献4)。该QProbe按照在末端具有结合有上述荧光色素的胞嘧啶碱基、当QProbe与目标核酸杂交时、胞嘧啶碱基与目标核酸中的鸟嘌呤碱基形成碱基对、将鸟嘌呤碱基配置于荧光色素附近的方式设计。因此，当QProbe与目标核酸杂交时，荧光色素由于配置在鸟嘌呤碱基的附近，因此发生消光。使用QProbe的核酸的检测方法中，利用杂交前后的荧光强度的减少量，对目标核酸进行定量。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表平6-500021号公报专利文献2：日本特开平10-262700号公报专利文献3：日本特表2004-511227号公报专利文献4：日本特开2001-286300号公报
技术实现思路
专利技术欲解决的技术问题但是，使用专利文献1～3中记载的核酸探针对目标核酸进行检测时，检测等需要昂贵的精密机器，费用高。此外，使用了专利文献1-3中记载的核酸探针的目标核酸的检测的工序数多、复杂，检测需要熟练。另外，通过本专利技术者们的研究，发现即便是QProbe，仍会发生难以以高灵敏度对目标核酸进行检测的情况等，从灵敏度的观点出发仍有进一步改善的余地。即，QProbe在距离结合有荧光色素的胞嘧啶碱基为1～7个碱基以内存在鸟嘌呤碱基时，通过与该鸟嘌呤碱基的相互作用，荧光色素的荧光强度降低。即，QProbe即便是未与目标核酸杂交，荧光色素的荧光强度也会下降。由此，杂交前后的荧光色素的荧光强度减少率减小、导致灵敏度降低。因此，在设计QProbe时，在核酸探针与目标核酸杂交的区域(以下称作“探针结合区域”)中，必须选择适于使QProbe杂交的区域，即为了保持高灵敏度、必须选择在距离与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内不存在胞嘧啶碱基的区域。本专利技术是鉴于该情况而完成的，其目的在于提供自由地选择探针结合区域、且能够实现高灵敏度的检测的手段。更具体而言，本专利技术的目的在于提供即便是在目标核酸的探针结合区域中，在探针上的距离与结合有荧光色素的胞嘧啶碱基相对的鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内存在胞嘧啶碱基时，灵敏度也优异的核酸探针。本专利技术的目的还在于提供对使用了上述核酸探针的目标核酸进行检测的方法。用于解决技术问题的手段为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种对目标核酸进行检测的第一核酸探针，其中，所述目标核酸具备所述第一核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域存在1个以上的胞嘧啶碱基，所述第一核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。第一核酸探针中，不具有荧光的消光作用的碱基优选是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一种碱基，更优选是次黄嘌呤碱基。本专利技术还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将第一核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度、对所述目标核酸进行检测的工序。对上述目标核酸进行检测的方法中，检测可以通过熔解曲线分析进行。本专利技术还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将上述第二核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序；和以所述混合液中含有的受检核酸为模板，进行核酸扩增反应，获得扩增产物的工序。所述扩增反应是包含反复进行变性阶段、退火阶段及延伸阶段的循环的聚合酶链反应。所述方法还具备在所述退火阶段中对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度对所述目标核酸进行检测的工序。本专利技术还提供一种对目标核酸进行检测的第二核酸探针，所述目标核酸具备所述第二核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域中存在1个以上的单核苷酸多态性，所述第二核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的单核苷酸多态性之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，该单核苷酸多态性中，与最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的单核苷酸多态性相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。第二核酸探针中，不具有荧光的消光作用的碱基优选是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一个碱基，更优选是次黄嘌呤碱基。本专利技术还提供一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将第二核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度，对所述目标核酸进行检测的工序。该检测可以通过熔解曲线分析进行，还可以通过熔解曲线分析对单核苷酸多态性进行检测。上述试样还可以含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对目标核酸进行检测的第一核酸探针，其中，所述目标核酸具备所述第一核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域中存在1个以上的胞嘧啶碱基，所述第一核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.09 JP 2016-0226591.一种对目标核酸进行检测的第一核酸探针，其中，所述目标核酸具备所述第一核酸探针进行杂交的探针结合区域，所述探针结合区域的至少一个末端为鸟嘌呤碱基、且在距离所述鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的所述探针结合区域中存在1个以上的胞嘧啶碱基，所述第一核酸探针具备末端具有与所述鸟嘌呤碱基相对的胞嘧啶碱基的寡核苷酸和结合在该胞嘧啶碱基上的荧光色素，所述荧光色素是在与鸟嘌呤碱基的相互作用下发生消光的荧光色素，所述寡核苷酸除了存在于距离所述末端鸟嘌呤碱基为1～7个碱基以内的胞嘧啶碱基之外、与所述探针结合区域的核酸互补，与该胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是鸟嘌呤碱基或不具有荧光的消光作用的碱基，其中，与该胞嘧啶碱基中最靠近所述末端鸟嘌呤碱基的胞嘧啶碱基相对的所述寡核苷酸上的碱基是不具有荧光的消光作用的碱基。2.根据权利要求1所述的第一核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是选自次黄嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及水粉蕈素中的任一种碱基。3.根据权利要求1所述的第一核酸探针，其中，所述不具有荧光的消光作用的碱基是次黄嘌呤碱基。4.一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将权利要求1～3中任一项所述的第一核酸探针与试样混合，制备混合液的工序；对所述混合液的荧光强度进行测定的工序；和基于所述荧光强度、对所述目标核酸进行检测的工序。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述检测通过熔解曲线分析进行。6.根据权利要求4～5中任一项所述的方法，其中，所述试样含有通过以受检核酸为模板的核酸扩增反应获得的扩增产物。7.一种对目标核酸进行检测的方法，其具备以下工序：将权利要求1～3中任一项所述的第一核酸探针与含有受检核酸的试样混合，制备混合液的工序，以所述混合液中含有的受检核酸为模板进行核酸扩增反应，获得扩增产物的工...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐伯辽平，
申请(专利权)人：荣研化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP