用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对和数据库及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对和数据库及其应用。本发明专利技术涉及一种穿山甲DNA微型条形码引物对及其设计方法，该引物对扩增效率高，质量好，测序成功率高；本发明专利技术涉及一种穿山甲DNA微型条形码数据库及其构建方法，该数据库序列长度为150bp，鉴别能力明显优于其它已知DNA条形码，能有效鉴别穿山甲属的7个主要种，包括中华穿山甲、南非穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲、长尾穿山甲、大穿山甲和菲律宾穿山甲；本发明专利技术涉及如上所述穿山甲DNA微型条形码数据库的应用，用于鉴别穿山甲品种，该鉴别方法简单易行，结果准确可靠，能有效用于穿山甲属物种识别、保护和相关研究。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对和数据库及其应用
本专利技术涉及DNA微型条形码引物对和数据库及其应用，利用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定，属于分子生物学
，特别涉及用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对和数据库及其应用。
技术介绍
甲片为鲮鲤科动物穿山甲(ManispentadactylaLinnaeus)的鳞甲，具有活血消癥、通经下乳、消肿排脓、搜风通络的功效，用于经闭癓瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛等，是我国传统名贵珍稀中药材。穿山甲生长在印度支那、锡金、太过北部、缅甸和中国的长江之南各省、海南岛以及台湾地区。上世纪90年代以后，国内的云南与广西等地区出现了很多由越南等地走私来的甲片，大部分是马来穿山甲(Manisjavanica)，还有少量印度穿山甲(Maniscrassicaudata)，并转运至海南、广东与福建等省份的药材市场。2000年，统计数据表明，历年有大概五百至八百千克甲片与两千只活体由云南边境走私进国内。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降。除使用穿山甲属其它动物鳞甲外，药材市场上还不断出现猪蹄甲(Susscrofadomestica)、黄牛蹄甲(Bostaurus)、耗牛蹄甲(B.grunniens)、山羊蹄甲(Caprahircus)、绵羊蹄甲(Ovisaries)等混伪品，严重影响了药材质量及用药的有效性、安全性。国内分子生物学技术应用于穿山甲，是通过十九类限制性内切酶以线粒体DNARFLP分析研究了十三只中华穿山甲，分析它们的遗传现状，最后得出褐色与灰色种群遗传具有显著不同点；贾静等提取了穿山甲腹面组织的DNA，以COI序列作为DNA条形码做出了穿山甲和混伪品鉴别，通过COI序列成功对穿山甲与混伪品猪蹄甲、黄牛蹄甲、耗牛蹄甲、水牛蹄甲、山羊蹄甲、绵羊蹄甲准确区分开。然而，市售穿山甲片大多经过炮制，其DNA含量少，降解严重，利用COI等长片段的通用条形码(650bp)难以从其中成功进行PCR扩增。微型条形码是指长度明显小于COI全长(650bp)的一段序列，这个概念是针对博物馆标本保存时间过长，部分DNA已降解，很难获得较完整的DNA序列，利用通用的COI引物很难获得目的条带，而较短的序列更加容易从这类部分DNA已降解的样品中扩增获得DNA序列。加拿大学者Hebert于2006年将200bp左右的序列应用于蛾类，并且成功利用所指定的200bp长度的序列有效鉴定该物种。由此，Hebert提出了DNA微型条形码的概念。DNA微型条形码在鉴定蛇类样品中已取得成功，对于保护濒危野生动物，预防印度的非法交易有着一定的促进作用。该种条码不仅可以鉴定动物分类，亦能够鉴定中药材和仿品，与传统DNA条形码进行对比，DNA序列长度比较短小是微型条形码的突出特点，不过二者的基本原理十分接近，基本的操作步骤是提取样品DNA，采集样品、特异性微型引物的设计与合成、PCR扩增、DNA测序、序列加工校正、序列分析。穿山甲甲片作为贵重的中药材，鉴于其鉴别的困难和资源保护的需求，积极探寻更为理想、有效的DNA微型条形码和鉴别技术，对穿山甲的保护和研究都具有十分重要的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对及其设计方法。该DNA微型条形码引物对扩增效率高，质量好，测序成功率高。另一方面，本专利技术的目的是提供一种用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码数据库及其构建方法。该DNA微型条形码数据库序列长度为150bp，该序列片段鉴别能力明显优于其它已知DNA条形码；该DNA微型条形码数据库利用短序列DNA片段就能有效鉴别穿山甲属的7个主要种，包括中华穿山甲、南非穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲、长尾穿山甲、大穿山甲、菲律宾穿山甲。再一方面，本专利技术的目的是提供一种利用DNA微型条形码引物对和数据库鉴别穿山甲品种的方法。该鉴别方法简单易行，结果准确可靠，能有效用于穿山甲属物种识别、保护和相关研究。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种穿山甲DNA微型条形码引物对，所述引物对为：COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC。进一步地，所述穿山甲的品种包括中华穿山甲(M.pentadactyla)、南非穿山甲(M.temminckii)、马来穿山甲(M.javanica)、树穿山甲(M.tricuspis)、长尾穿山甲(M.tetradactyla)、大穿山甲(M.gigantea)、菲律宾穿山甲(M.culionensis)。本专利技术提供如上所述穿山甲DNA微型条形码引物对的设计方法，包括以下步骤：从GENBANK中下载穿山甲属物种、以及甲片常见伪品的原动物的COI基因序列，进行序列比较，设计微型鉴别引物COIB-F和COIB-R后合成。进一步地，所述序列比较为使用MEGA5.0，人工选取不易突变、较为保守的基因片段；所述设计微型鉴别引物为使用软件PrimerPremie5.0进行设计的。本专利技术提供一种穿山甲DNA微型条形码数据库，其碱基序列如序列表SEQIDNO.1-7所示。其中，SEQIDNO.1为中华穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.2为南非穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.3为马来穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.4为树穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.5为长尾穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.6为大穿山甲的碱基序列表、SEQIDNO.7为菲律宾穿山甲的碱基序列表。本专利技术提供一种穿山甲DNA微型条形码数据库的构建方法，包括以下步骤：(1)提取待测物种的DNA；(2)用穿山甲DNA微型条形码引物对对待测物种的DNA进行PCR扩增；所述穿山甲DNA微型条形码引物对为：COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC；(3)PCR扩增产物的检测、测序与人工修正。进一步地，步骤(1)中，所述待测物种DNA的提取采用改良SDS法，包括以下步骤：①用无水乙醇浸泡穿山甲甲片12h，每隔3h更换一次无水乙醇，期间在振荡器上轻微震荡清洗；浸泡完毕后，用去离子水做同样的操作；在60℃下烘干，在紫外灯下正反面分别照射灭菌30min，然后用已灭菌的剪刀剪至细末；②取0.4g甲片粉末置于1.5mL离心管中，加入1mL浸泡液(10mmol/LTris-HCl、0.2mol/LEDTA、50mmol/LNaCl、PH8.0)于4℃放置过夜，5000rpm离心10min后弃上清液；③加入1mL含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h，充分震荡，10000rpm高速离心10min后弃上清液；④向沉淀中加入1mL含有10mmol/LTris-HCl、50mmol/LNaCl、2％SDS、1mmol/LDTT、1mmol/LCaCl2和100μL蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h，期间每4h轻轻震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清；⑤此后抽提等步骤按常规DNA提取方法进行；抽提步骤1：加入等体积平衡酚(约7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种穿山甲DNA微型条形码引物对，其特征在于，所述引物对为：COIB‑F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；COIB‑R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC。

【技术特征摘要】
1.一种穿山甲DNA微型条形码引物对，其特征在于，所述引物对为：COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC。2.根据权利要求1所述的DNA微型条形码引物对，其特征在于：所述穿山甲的品种包括中华穿山甲、南非穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲、长尾穿山甲、大穿山甲、菲律宾穿山甲。3.权利要求1所述的穿山甲DNA微型条形码引物对的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：从GENBANK中下载穿山甲属物种、以及甲片常见伪品的原动物的COI基因序列，进行序列比较，设计微型鉴别引物COIB-F和COIB-R后合成。4.根据权利要求3的DNA微型条形码引物对的设计方法，其特征在于：所述序列比较为使用MEGA5.0，人工选取基因片段；所述设计微型鉴别引物为使用软件PrimerPremie5.0进行设计的。5.一种穿山甲DNA微型条形码数据库，其特征在于：其碱基序列如序列表SEQIDNO.1-7示。6.一种穿山甲DNA微型条形码数据库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测物种的DNA；(2)用穿山甲DNA微型条形码引物对对待测物种的DNA进行PCR扩增；所述穿山甲DNA微型条形码引物对为：COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC；(3)PCR扩增产物的检测、测序与人工修正。7.根据权利要求6所述的DNA微型条形码数据库的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述待测物种DNA的提取采用改良SDS法，包括以下步骤：①用无水乙醇浸泡穿山甲甲片12h，每隔3h更换一次无水乙醇，期间在振荡器上轻微震荡清洗；浸泡完毕后，用去离子水做同样的操作；在60℃下烘干，在紫外灯下正反面分别照射灭菌30min，制成粉末状；所述制成粉末状为采用已灭菌的剪刀剪至细末或者用液氮在研钵中研磨成粉末；②取0.4g甲片粉末置于1.5mL离心管中，加入1mL浸泡液(10mmol/LTris-HCl、0.2mol/LEDTA、50mmol/LNaCl、PH8.0)于4℃放置过夜，5000rpm离心10min后弃上清液；③加入1mL含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h，充分震荡，10000rpm高速离心10min后弃上清液；④向沉淀中加入1mL含有10mmol/LTris-HCl、50mmol/LNaCl、2％SDS、1mmol/LDTT、1mmol/LCaCl2和100μL蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴消化，期间每4h轻轻震荡混匀一次，10000rpm离心10min取上清；所述55℃水浴消化时间为72h或者120h；⑤以平衡酚进...

【专利技术属性】
技术研发人员：晁志，蔡炫，叶浩婷，田恩伟，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44