一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。本发明专利技术利用双金属Pd@Pt纳米粒子负载氨基功能化MoSe2作为催化材料，与检测抗体孵化后作为标记物，同时利用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为电极修饰材料，成功构建了夹心型免疫传感器，从而实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的检测，具备灵敏度高，特异性强，检测限低等优势，对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感
，涉及一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd@Pt/MoSe2为检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的灵敏检测。
技术介绍
癌症是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率的疾病。虽然恶性肿瘤的治疗技术在不断进步，但迄今为止，恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗仍然是治疗恶性肿瘤最有效的手段。肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质，绝大多数存在于恶性肿瘤中，血清中肿瘤标志物的检测对肿瘤预警及早期诊断具有重要的科学意义和应用前景。因此，降低肿瘤死亡率的主要途径是实现早期对肿瘤标志物的灵敏检测。目前临床血清肿瘤标志物的免疫检测方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法等，但无法避免放射污染、耗时、灵敏度不够等缺点。因此，专利技术一种特异性强，灵敏度高，检测速度快，操作简便的免疫传感器十分重要。电化学免疫传感器主要利用抗原与抗体间高度特异性结合的特性，将免疫分析法和电化学传感器相结合，具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等独特优势，已广泛用于各种肿瘤标志物的检测，同时在环境监测、食品安全控制、生物监测、临床检验等领域发挥重要作用。金纳米棒负载氨基功能化石墨烯具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以显著提高捕获Ab1的固载量；石墨烯良好的电子传递能力可以增强电极的导电性。Pd@Pt/MoSe2能够提供良好的催化作用，MoSe2具有较大的比表面积能够提高Pd@PtNPs的负载量从而提高捕获Ab2的固载量，同时减少贵金属的团聚作用。本专利技术采用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为基底材料，Pd@Pt/MoSe2作为催化材料与检测抗体进行孵化作为标记物，构建了用于肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器。
技术实现思路
本专利技术提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器应用于肿瘤标志物NSE、SCCA的高灵敏、特异性检测。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~3.0mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6µL、8.0~12.0µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.5~2.0mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、0.1pg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（6）将6µL、1.5~3.5mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。2.所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：（1）金纳米棒溶液的制备将95~105μL、质量分数为1%的氯金酸和350~370mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡15~20min；磁力搅拌下快速加入50~70μL、0.1mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2~4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将380~420μL、质量分数为1%的氯金酸和700~780mg十六烷基三甲基溴化铵及15~25μL、0.1mol/L硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25~45min；加入90~120μL、0.1mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20μL金纳米种子溶液，震荡30~40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；（2）氧化石墨烯的制备将1~2g石墨薄片和0.5~1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min；搅拌下加入3~4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至90°C~95°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水；再依次加入140mL超纯水和10~15mL、质量分数为30%的H2O2溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1mol/L的HCl溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40~50mg氧化石墨烯和10~15mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3~0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10~14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；将20~30mg氨基功能化石墨烯加至10mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。3.所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe2-Ab2溶液的制备，步骤如下：（1）功能化PdNPs分散液的制备依次取90~110mg聚乙烯吡咯烷酮，550~650mg溴化钾和60~70mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80°C保持10min；在磁力搅拌下加入50~70mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得PdNPs，重新分散在10mL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取180~200mg十六烷基三甲基溴化铵和25~30mg溴水杨酸溶于10mL超纯水中；加入1.0~2.0mL的PdNPs分散液，超声震荡5~9min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；（2）Pd@PtNPs分散液的制备将250~270μL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超声震荡1~2min，快速加入1mL、0.01mol/L的抗坏血酸溶液，快速震荡10~15s，静置8~10h，超纯水离心洗涤，重新分散于10mL超纯水中，制得Pd@PtNPs分散液；（3）氨基化MoSe2的制备将150~170mg硒粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2~3h，制得溶液A；将200~280mg钼酸钠加入到20mL超纯水中，制得溶液B；将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200°C加热24h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60°C的真空干燥箱中干燥16~24h，制得MoSe2；将100mgMoSe2和160~200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷依次加入到10mL无水乙醇中，70°C回流60~70min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；（4）继续将3 µL、0.5 ~ 2.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（5）滴加6 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（6）将6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe2‑Ab2溶液滴至电极表面，置于4 °C冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~3.0mg/mL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6µL、8.0~12.0µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.5~2.0mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、10fg/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（6）将6µL、1.5~3.5mg/mL检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，其特征在于，步骤如下：（1）金纳米棒溶液的制备将95~105μL、质量分数为1%的氯金酸和350~370mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡15~20min；磁力搅拌下快速加入50~70μL、0.1mol/L新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2~4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将380~420μL、质量分数为1%的氯金酸和700~780mg十六烷基三甲基溴化铵及15~25μL、0.1mol/L硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25~45min；加入90~120μL、0.1mol/L新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20μL金纳米种子溶液，震荡30~40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；（2）氧化石墨烯的制备将1~2g石墨薄片和0.5~1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min；搅拌下加入3~4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至90°C~95°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水；再依次加入140mL超纯水和10~15mL、质量分数为30%的H2O2溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1mol/L的HCl溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40~50mg氧化石墨烯和10~15mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3~0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10~14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；将20~30mg氨基功能化石墨烯加至10mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。3.如权利要求1所述的一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物Pd@Pt/MoSe2-Ab2溶液的制备，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，张栓，张春燕，贾翌雷，赵增典，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37