一种基于金纳米棒蚀刻的比色法检测脂肪酶活制造技术

本发明专利技术公开了一种基于金纳米棒蚀刻检测脂肪酶活的比色法。本发明专利技术以吐温80可自氧化产生过氧化氢，为过氧化氢‑辣根过氧化物酶‑四甲基联苯胺(H2O2‑HRP‑TMB)体系提供过氧化氢以产生TMB+，向体系中加入盐酸来结束TMB+的产生并为TMB+氧化为TMB2+提供条件，TMB2+可对金纳米棒进行蚀刻，同时吐温80作为脂肪酶的底物。由此发展出一种成本低，操作简单，灵敏度高为特点的检测脂肪酶活比色分析法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米棒蚀刻的比色法检测脂肪酶活
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种以金纳米棒作为显色元件，吐温80作为脂肪酶识别元件且作为H2O2-HRP-TMB体系中过氧化氢的来源，用于检测脂肪酶酶活的纳米生物传感器。
技术介绍
金属纳米材料的溶液颜色通常依赖于材料本身的尺寸，颜色的改变主要受其形状、大小和组成的调控，使其在电子、催化、光学和生物传感器等领域具有广泛的应用前景。在这些金属纳米材料中，金纳米颗粒(AuNPs)在可见光和近红外区域表现出强烈的局域表面等离子体共振(LSPR)，使其广泛应用于比色传感器，金纳米棒(AuNRs)是一种典型的等离子体一维纳米结构，其分别具有横向和纵向两个独立的表面等离子体共振带(SPR)，其纵向吸收峰的位置与金纳米棒的长径比密切相关，通过对金纳米棒长径比的调节，可以在很宽的波长范围内获得不同的光学信号，如何改变其长径比成为各个应用领域探索的问题，金纳米棒受到越来越多的关注。到目前为止，已经提出许多金纳米棒形态改变的方法，Lu等人利用金纳米棒头碰头连接来检测乙酰胆碱酯酶，LauraSaa等人采用金纳米棒的蚀刻来检测人体血液中的葡萄糖，Chen等人基于金属离子在金纳米棒上的沉积对大肠杆菌进行检测等。脂肪酶(三酰甘油水解酶)在生物医药科学、化学工业、食品领域和化妆品等迅速发展的生物科技领域已经成为一种关键的酶类，对于酶工程和生物工业来说，高灵敏度和高选择性的检测检测脂肪酶活性被认为是一种重要的工具。与其他裂解酶有所不同，如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和乙酰胆碱酯酶等它们的水解反应是发生在均相水溶液中，而脂肪酶比较特殊，脂肪酶的催化水解反应发生在油-水界面上，水溶性不好的底物的乳化会极大地影响脂肪酶活性的检测，因此，建立一种在油-水界面检测脂肪酶活的可靠检测方法显得非常重要。到目前为止，检测脂肪酶活性的方法通常需要复杂的仪器和专业的操作，例如基于荧光、光致发光和化学发光等方法，相比之下，比色检测由于其简单、方便、成本低、实用性强和用眼睛直接得出结果等显示出明显的优势，然而，常规的比色生物传感器灵敏度相对较低从而限制了它的应用。因此，开发出一种灵敏度高、选择性强的检测脂肪酶的比色法是十分重要的。现有未公开基于金纳米棒作为生物传感器来比色检测脂肪酶活的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于金纳米棒蚀刻用于简单、方便、可视化的脂肪酶活检测方法。此方法首次将金纳米棒蚀刻与脂肪酶活检测相结合。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案：(1)吐温80水解试样的制备；(2)将步骤(1)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到包含有HRP和TMB的溶液中；(3)然后向步骤(2)溶液中加入一定量的盐酸来终止TMB+的产生并为TMB+氧化为TMB2+提供环境；(4)移取一定量步骤(3)中的溶液加入到使用一定浓度十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)再分散的金纳米棒溶液中，混匀，在室温下放置一段时间后，在波长范围在400-950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制标准曲线。本专利技术所述的检测脂肪酶活的比色法，所述步骤(1)所述使用底物吐温的浓度为16.29mmol/L。本专利技术所述的检测脂肪酶活的比色法，所述步骤(2)中首次将吐温80自氧化产生的过氧化氢来作为H2O2-HRP-TMB体系中过氧化氢的来源。本专利技术所述的检测脂肪酶活的比色法，所述步骤(2)中辣根过氧化物酶的最优浓度为20μg/mL。本专利技术所述的检测脂肪酶活的比色法，所述步骤(3)中盐酸的最优浓度为0.3mol/L。本专利技术所述的检测脂肪酶活的比色法，所述步骤(4)中CTAB的最佳浓度为0.08mol/L。附图说明图1(A)为高纵横比的金纳米棒的紫外光谱图；图(B)吐温80未被脂肪酶水解金纳米棒的紫外光谱图；(C)吐温80被脂肪酶水解金纳米棒的紫外光谱图。图2为机理验证图。(I)辣根过氧化物酶+四甲基联苯胺+盐酸+金纳米棒；II)吐温80+四甲基联苯胺+盐酸+金纳米棒；III)吐温80+辣根过氧化物酶+盐酸+金纳米棒；IV)吐温80+辣根过氧化物酶+四甲基联苯胺+金纳米棒；V)吐温80+辣根过氧化物酶+四甲基联苯胺+盐酸+金纳米棒；VI)吐温80+脂肪酶+辣根过氧化物酶+四甲基联苯胺+盐酸+金纳米棒和VII)过氧化氢+辣根过氧化物酶+四甲基联苯胺+盐酸+金纳米棒)。图3a为脂肪酶的标准曲线；b为脂肪酶浓度与金纳米棒纵向吸收峰的差值呈线性部分。具体实施方式实施例1实验机理的验证(1)步骤(1)吐温80试样的制备准备3个2.0mL离心管编号a、b，分别向a、b离心管中加入吐温溶液的最终浓度为2％(v/v)，分别向离心管中加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至9；后向b离心管中加入待测脂肪酶溶液(2mg/mL)，a离心管中不加脂肪酶溶液；混匀，调节反应温度至45℃反应45min，待用。(2)步骤(2)检测溶液的配制准备7个2.0mL离心管编号为I-VII，在I号管中加入250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)、500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀，；II号管中加入250μL步骤(1)中a溶液、500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀；III号管中加入250μL步骤(1)中a溶液、250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀；IV号管中加入250μL步骤(1)中a溶液、250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)和500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)；V号管中加入250μL步骤(1)中a溶液、250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)、500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀；VI号管中加入加入250μL步骤(1)中b溶液、250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)、500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀；VIII号管中加入250μL过氧化氢溶液(0.5μmol/L)、250μL辣根过氧化物酶溶液(20μg/mL)、500μL四甲基联苯胺溶液(2mg/mL)和10μL盐酸(0.3mol/L)混匀，补足体积至1.0mL，待用。(3)步骤(3)反应物的添加将步骤(2)中配置好的溶液分别取200μL加入到800μL金纳米棒溶液中，混匀，反应一段时间后，分别移取200μL反应溶液到96孔酶标板中进行紫外分光的检测，检测结果如图2所示。由I、II、III可以发现，H2O2-HRP-TMB体系中缺少任何一种物质时，都不会有TMB+产生，即体系中没有TMB2+，无法对金纳米棒蚀刻，金纳米棒的纵向吸收峰不会发生蓝移；由IV可以发现，体系中有TMB+产生时，但没有盐酸的加入也不会产生TMB2+，金纳米棒不会被蚀刻，金纳米棒的纵向吸收峰也不会发生蓝移；由V可以发现，当体系中同时存在吐温80、辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、盐酸和金纳米棒，金纳米棒被蚀刻并且金纳米棒的纵向吸收峰出现明显的位移；由VI可以发现，吐温80被脂肪酶水解后，金纳米棒的蚀刻被抑制，金纳米棒纵向吸收峰蓝移也被抑制；由VII可以发现，金纳米棒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测脂肪酶酶活的比色法，使用金纳米棒作为显色元件，吐温80作为过氧化氢‑辣根过氧化物酶‑四甲基联苯胺(H2O2‑HRP‑TMB)体系中过氧化氢的来源，并且作为脂肪酶的底物。其特征在于，具体包括如下步骤：(1)吐温80水解试样的制备；(2)将步骤(1)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到包含有HRP和TMB的溶液中；(3)然后向步骤(2)溶液中加入一定量的盐酸来终止TMB+的产生并为TMB+氧化为TMB2+提供环境；(4)移取一定量步骤(3)中的溶液加入到使用一定浓度十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)再分散的金纳米棒溶液中，混匀，在室温下放置一段时间后，在波长范围在400‑950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐标，绘制标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种检测脂肪酶酶活的比色法，使用金纳米棒作为显色元件，吐温80作为过氧化氢-辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺(H2O2-HRP-TMB)体系中过氧化氢的来源，并且作为脂肪酶的底物。其特征在于，具体包括如下步骤：(1)吐温80水解试样的制备；(2)将步骤(1)由不同脂肪酶浓度水解的吐温试样溶液加入到包含有HRP和TMB的溶液中；(3)然后向步骤(2)溶液中加入一定量的盐酸来终止TMB+的产生并为TMB+氧化为TMB2+提供环境；(4)移取一定量步骤(3)中的溶液加入到使用一定浓度十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)再分散的金纳米棒溶液中，混匀，在室温下放置一段时间后，在波长范围在400-950nm检测其吸光度，以吸光强度作为纵坐标，波长为横坐...

【专利技术属性】
技术研发人员：田丹碧，张凌华，朱杰，吴胜男，张浩，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32