一种种牛性控精液低温保存方法技术

本发明专利技术属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种种牛性控精液低温保存方法：包括如下步骤：采集、检测、过滤、加抗生素、染色、水浴、加egg yolk、甘油乳化、精子沉淀物的悬混、计数、加样、灌装、冷冻、抽检、液氮保存，在牛冻精生产中，鲜精接入后先置于33℃水浴锅内，经过初步检测后直接置于19℃环境中最后放入低温操作柜内降温平衡后，封装打印,通过这一步骤，可以有效地使精子逐步适应下降的温度，减缓能量损失，减少死亡。

【技术实现步骤摘要】
一种种牛性控精液低温保存方法
本专利技术属于牛冻精生产
，具体涉及一种种牛性控精液低温保存方法。
技术介绍
自从2000年英国生产出定性的精子产品以来，我国奶牛性控技术产业化发展十分迅速，如今已非常成熟，达到了国际领先水平。性控冻精已进入商业化生产，使用性控冻精进行人工授精，它具有产母(公)犊率高、操作简单等利于在生产中大面积推广的优点，且其所产犊牛与使用常规冻精所产犊牛相比，在体重、体尺等生长发育指标上无明显差别，适合规模化、产业化发展的中小型奶牛场快速扩群。但是性控冻精的受胎率略低于常规冻精的受胎率，为此需要优化整个精液低温保存过程，以期达到性控冻精的受胎率与常规冻精的受胎率持平。专利申请号201710669949.4公开了一种种牛精液低温保存方法，该保温方法较适宜于常规种牛的低温保存，对于性控精液的低温保存若采用此方法，受胎率较低，为此需要开发一种种牛性控精液低温保存方法。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足之处，本专利技术的目的就在于提供一种牛精液低温保存方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种种牛性控精液低温保存方法，包括以下步骤：步骤(1)采集：采集成熟度好的牛精液，放入33℃水浴锅中备用；步骤(2)检测：对步骤(1)采集的精液进行品质检测，要求活力≥0.65、密度≥8亿/m，保留合格精液，弃掉不合格精液；步骤(3)过滤：将步骤(2)检测合格的精液用过滤筛过滤掉杂质，滤液转移至15ml离心管中，过滤操作在室温19℃下进行；步骤(4)加抗生素：原精转移至离心管后第一时间加入混合抗生素css，摇匀后放入19℃的恒温箱中，备用；步骤(5)染色：原精取回前将Staining液放入33℃的水浴锅中预热；按照用量取用步骤(4)加有抗生素的精液，并向精液中加入Staining液和荧光染料HO33342；步骤(6)水浴：将步骤(5)所得的染色后的精液放入水浴锅内暗室水浴48分钟；步骤(7)加eggyolk：将步骤(6)的精液从水浴锅中取出，并向精液中加入终浓度的为4％的eggyolk，摇匀后经过50微米过滤器过滤至5ml上样管内，用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，将沉淀的X或Y精子置于4℃冷却室中保存，备用；步骤(8)甘油乳化：将沉淀的X精子或Y精子置于离心机的离心管中，离心机的温度参数为4℃，向离心管中加入甘油，用于乳化X精子或Y精子；将乳化后的X精子或Y精子置于离心机中，离心时长控制在20分钟，离心后，弃上清液，用4℃隔离冷却器将含X精子或Y精子的离心管运回4℃冷却室；步骤(9)精子沉淀物的悬混在4℃条件下将留下的精子沉淀物悬混，混悬时长为15秒；将悬混后的精子沉淀物收集到已称重的离心管中；步骤(10)计数采用血细胞计数板计数法对步骤(9)的精子沉淀物进行取样计数；步骤(11)加样向步骤(9)悬混后的精子沉淀物中依次加入TrisA和TrisB，摇匀后灌装、冷冻，冷冻结束后抽检，抽检合格移入液氮罐中保存，备用。优选地，上述种牛精液低温保存方法，所述的Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L；Staining液的配置方法为：将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，搅拌，分别依次加入Hepes、MgCl2·6H2O、NaCl、KCl、Na2HPO4、NaHCO3、Napy、葡萄糖、Nalatctate和BSA摇匀后，采用NaOH溶液调节PH值至7.4，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，封膜摇匀；将容量瓶中的液体静置24h后过滤，滤液置于试剂瓶中，待用；在使用前向试剂瓶中加入终浓度为2.5ml/L的庆大霉素。优选地，上述种牛精液低温保存方法，步骤(4)中，混合抗生素css的用量为：离心管中1ml精液加20微升抗生素css。优选地，上述种牛精液低温保存方法，所述的混合抗生素css包括泰勒菌素、林肯霉素和庆大霉素，所述的林肯霉素、泰勒菌素和庆大霉素的体积比为3:3:4。所述的泰勒菌素由0.76g酒石酸泰勒菌素与40ml2.9％柠檬酸钠混合均匀而成；所述的林肯霉素由壮观霉素：林肯霉素：2.9％柠檬酸钠按照4g：2g：40ml的比例配置而成；所述的庆大霉素的浓度为16mg(1.6万)/ml。优选地，上述种牛精液低温保存方法，步骤(5)中，所述的染色的具体步骤为：在5ml上样管上标明牛号、批次，打开HO33342(5mg/ml)荧光染料瓶，用微量加样器吸取荧光染料，用消毒后的抽纸轻轻擦拭微量加样器端部后，将荧光染料加入到5ml上样管中，向5ml上样管中加入预热后的Staining液，振荡数秒，取用步骤(4)加有抗生素的精液4ml，并将其转移至5ml上样管中，摇匀5ml上样管3-4次。所述荧光染料的加入量是根据精液密度决定的，密度为4～7亿/ml，荧光染料加30～32uL，密度为8～10亿/ml，荧光染料加28uL，密度为10～14亿/ml，荧光染料加26uL，密度为15～18亿/ml，荧光染料加22/24uL，密度为18～20亿/ml，荧光染料加20uL。优选地，上述种牛精液低温保存方法，步骤(7)中，终浓度为4％的eggyolk的配置方法为为a.称取丙酮酸钠0.22g、葡萄糖0.9g、乳酸钠3.61g、BSA3.2g于烧杯中加少量超纯水充分溶解，b.待溶解完后再加入2.61ml食品红，于容量瓶中定容至1000ml，c.倒926.6ml于量筒中，再吸取4.2ml弃去，d.加入卵黄至1000ml，再将容量瓶中剩余的倒入，总量为1037.4ml。e.将量筒封口，上下颠倒摇匀，放入冰箱中静置12h左右，吸去上层油膜。d.用移液管和软管连接吸去下层沉淀，移至烧杯中调pH至5.5，静置30min，弃去沉淀，保存于冰箱待用。优选地，上述种牛精液低温保存方法，步骤(8)中，甘油的加入量等于离心管中液量，甘油的加入方式如下：将沉淀的X精子或Y精子置于50ml离心管中，离心机的温度参数为4℃，将甘油用量的1/2加入50ml离心管中，混匀乳化15分钟后再加入剩下的1/2甘油，乳化15分钟。本申请文件中所述的泰勒菌素，泰勒菌素配置方法为将0.76g酒石酸泰勒菌素(Tylosintartrate)与40ml2.9％(质量分数，下同)柠檬酸钠混合均匀即制得泰勒菌素；本申请文件中所述的林肯霉素，林肯霉素的配置方法为：以壮观霉素(Spectinomycindihydrochloridepentahydrate)：林肯霉素(Lincomycinhydrochloride)：2.9％柠檬酸钠的比例为4g：2g：40ml配置而成的混合液为林肯霉素。需要说明的是：本申请文件中所述的“第一时间”的含义是尽快完成某过程。与现有技术相比较，本专利技术所述的牛精液低温保存方法，具有如下创新点：调整温度：在牛冻精生产中，鲜精接入后先置于33℃水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种种牛性控精液低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)采集：采集成熟度好的牛精液，放入33℃水浴锅中备用；步骤(2)检测：对步骤(1)采集的精液进行品质检测，要求活力≥0.65、密度≥8亿/m，保留合格精液，弃掉不合格精液；步骤(3)过滤：将步骤(2)检测合格的精液用过滤筛过滤掉杂质，滤液转移至15ml离心管中，过滤操作在室温19℃下进行；步骤(4)加抗生素：原精转移至离心管后第一时间加入混合抗生素css，摇匀后放入19℃的恒温箱中，备用；步骤(5)染色：原精取回前将Staining液放入33℃的水浴锅中预热；按照用量取用步骤(4)加有抗生素的精液，并向精液中加入Staining液和荧光染料HO33342；步骤(6)水浴：将步骤(5)所得的染色后的精液放入37℃水浴锅内暗室水浴48分钟；步骤(7)加egg yolk：将步骤(6)的精液从水浴锅中取出，并向精液中加入终浓度的为4％的egg yolk，摇匀后经过50微米过滤器过滤至5ml上样管内，用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，将沉淀的X或Y精子置于4℃冷却室中保存，备用；步骤(8)甘油乳化：将沉淀的X精子或Y精子置于离心机的离心管中，离心机的温度参数为4℃，向离心管中加入甘油，用于乳化X精子或Y精子；将乳化后的X精子或Y精子置于离心机中，离心时长控制在20分钟，离心后，弃上清液，用4℃隔离冷却器将含X精子或Y精子的离心管运回4℃冷却室；步骤(9)精子沉淀物的悬混在4℃条件下将留下的精子沉淀物悬混，混悬时长为15秒；将悬混后的精子沉淀物收集到已称重的离心管中；步骤(10)计数采用血细胞计数板计数法对步骤(9)的精子沉淀物进行取样计数；步骤(11)加样向步骤(9)悬混后的精子沉淀物中依次加入Tris A和Tris B，摇匀后灌装、冷冻，冷冻结束后抽检，抽检合格移入液氮罐中保存，备用。...

【技术特征摘要】
1.一种种牛性控精液低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)采集：采集成熟度好的牛精液，放入33℃水浴锅中备用；步骤(2)检测：对步骤(1)采集的精液进行品质检测，要求活力≥0.65、密度≥8亿/m，保留合格精液，弃掉不合格精液；步骤(3)过滤：将步骤(2)检测合格的精液用过滤筛过滤掉杂质，滤液转移至15ml离心管中，过滤操作在室温19℃下进行；步骤(4)加抗生素：原精转移至离心管后第一时间加入混合抗生素css，摇匀后放入19℃的恒温箱中，备用；步骤(5)染色：原精取回前将Staining液放入33℃的水浴锅中预热；按照用量取用步骤(4)加有抗生素的精液，并向精液中加入Staining液和荧光染料HO33342；步骤(6)水浴：将步骤(5)所得的染色后的精液放入37℃水浴锅内暗室水浴48分钟；步骤(7)加eggyolk：将步骤(6)的精液从水浴锅中取出，并向精液中加入终浓度的为4％的eggyolk，摇匀后经过50微米过滤器过滤至5ml上样管内，用流式细胞仪使X、Y精子分离，将X或Y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀X或Y精子，将沉淀的X或Y精子置于4℃冷却室中保存，备用；步骤(8)甘油乳化：将沉淀的X精子或Y精子置于离心机的离心管中，离心机的温度参数为4℃，向离心管中加入甘油，用于乳化X精子或Y精子；将乳化后的X精子或Y精子置于离心机中，离心时长控制在20分钟，离心后，弃上清液，用4℃隔离冷却器将含X精子或Y精子的离心管运回4℃冷却室；步骤(9)精子沉淀物的悬混在4℃条件下将留下的精子沉淀物悬混，混悬时长为15秒；将悬混后的精子沉淀物收集到已称重的离心管中；步骤(10)计数采用血细胞计数板计数法对步骤(9)的精子沉淀物进行取样计数；步骤(11)加样向步骤(9)悬混后的精子沉淀物中依次加入TrisA和TrisB，摇匀后灌装、冷冻，冷冻结束后抽检，抽检合格移入液氮罐中保存，备用。2.根据权利要求1所述的一种种牛性控精液低温保存方法，其特征在于，所述的Staining液中各成分及其终浓度为：Hepes：9.520g/L，MgCl2·6H2O：0.08g/L，NaCl：5.518g/L，KCl：0.224g/L，Na2HPO4：0.04g/L，NaHCO3：0.84g/L，Napy：0.22g/L，葡萄糖：0.90g/L，Nalatctate：3.61ml/L，BSA：3.0g/L，庆大霉素：2.5ml/L。3.根据权利要求2所述的一种种牛性控精液低温保存方法，其特征在于，所述的Staining液的配置方法为：将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，搅拌，分别依次加入Hepes、MgCl2·6...

【专利技术属性】
技术研发人员：高汉婷，王天军，衡振月，陈志南，高留涛，田全召，
申请(专利权)人：河南省鼎元种牛育种有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41