三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法技术
Three element shuttle vector and its application in constructing CLBV infectious clone
The invention discloses a three yuan shuttle carrier pCY, and its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:17. A method for constructing CLBV infectious clones was also disclosed: (1) Total RNA from CLBV infected plants was extracted, and then reverse transcribed by PCR with pCY_CLBV1F, CLBV1R, CLBV2F and pCY_CLBV2R, respectively. Specific fragments CLBV1 and CLBV2 covering the full length of the CLBV genome were obtained; (2) Stu I and Sma I enzyme digestion of pCY was performed; (3) TAR cloning: pCY was digested with acetic acid. CLBV1, CLBV2 and linearized pCY were co-transformed into yeast YPH501 by lithium method, and full-length CLBV cDNA clone pCY_CLBV was obtained by homologous recombination; (4) pCY_CLBV plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens, inoculated with citrus or native tobacco, and CLBV infectious clone was identified.
【技术实现步骤摘要】
三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法。
技术介绍
柑桔叶斑驳病毒(Citrusleafblotchvirus，CLBV)属乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)柑桔病毒属(Citrivirus)的代表成员，可以通过嫁接侵染大多数的柑桔品种，还可以通过种子传播，具有一定的传播流行风险。构建CLBV侵染性克隆将有助于了解其分子特性及致病机理，对于CLBV的流行防控也具有重要作用。另外，CLBV在多数柑桔品种上不会引起明显的病毒感染症状，有望开发成为具有广泛应用前景的病毒载体。CLBV基因组大小约为8.7kb，包含三个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，分别编码复制相关蛋白、运动蛋白及外壳蛋白，其中运动蛋白为沉默抑制子，5’-端有甲基化帽子结构，3’-端有polyA尾巴。侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。...
【技术保护点】
1.一种三元穿梭载体pCY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
【技术特征摘要】
1.一种三元穿梭载体pCY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:17所示。2.一种构建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取感染CLBV植株的总RNA，反转录后以cDNA作为模板，采用两对特异引物pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2；所述引物pCY-CLBV1F、CLBV1R、CLBV2F、pCY-CLBV2R的序列分别如SEQIDNO:3～6所示；(2)采用限制性内切酶StuI、SmaI酶切如SEQIDNO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CLBV1、CLBV2和线性化三元...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋震，崔甜甜，宾羽，晏建红，李中安，周常勇，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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