一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。本发明专利技术以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。载体甲采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，且载体中的修复模板只含有左侧同源臂。载体乙同样采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，但载体中的修复模板含有两个同源臂。利用基因枪方法将载体与外源片段同时转入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。研究结果一方面表明，当双链DNA作为修复模板时，细胞采用SDSA模型进行同源重组修复，且当修复模板中只含有左侧同源重组臂时同样可成功介导目的基因的同源重组，此策略使得载体构建更为简单。

A method of homologous recombination of target genes in plants using CRISPR/LbCpf1 system

The invention discloses a method for homologous recombination of target genes in plants by using CRISPR/LbCpf1 system. The invention is based on the rice ALS gene, and constructs a homologous recombination vector. Vector A used OsU3 as promoter to initiate the transcription of crRNA, and the repair template contained only the left homologous arm. Vector B also uses OsU3 as promoter to initiate the transcription of crRNAs, but the repair template in the vector contains two homologous arms. The vector and exogenous fragments were simultaneously transferred into rice callus by gene gun method, and the rice plants modified by ALS gene were obtained. On the one hand, the results showed that when double-stranded DNA was used as repair template, the cells were repaired by homologous recombination using SDSA model, and when the repair template contained only the left homologous recombinant arm, the homologous recombination of the target gene could also be successfully mediated. This strategy made the construction of the vector easier.

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法
本专利技术涉及一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一，首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9两部分组成。CRISPR/Cas系统是通过自身的核酸内切酶活性引起基因组靶位点DNA序列双链断裂(double-strandbreaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directedrepair，HDR)两种方式引入突变。细胞通过NHEJ途径进行修复时，通常会导致小片段的插入或缺失，从而导致基因功能丧失，因此常用于目的基因的功能研究。而HDR不同于NHEJ，此修复途径通常需要DNA修复模板的参与，根据HDR途径的修复特点，已将发展成为一种有效的基因组编辑工具：对靶基因进行定点修饰或定点插入外源基因，从而改良生物性状。鉴于HDR的重要性，众多学者对其作用机制进行了探究。目前，围绕HDR如何对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；所述元件丙为元件丙‑1或元件丙‑2；所述元件丙‑1中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段A；所述模板区段A包括上游同源臂和供体片段序列；所述元件丙‑2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段B；所述模板区段B包括上游同源臂、供体片段序列和下...

【技术特征摘要】
1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；所述元件丙为元件丙-1或元件丙-2；所述元件丙-1中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段A；所述模板区段A包括上游同源臂和供体片段序列；所述元件丙-2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段B；所述模板区段B包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于：区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；所述元件丙-1中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列和crRNA2的靶标序列；所述元件丙-2中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，李少雅，赵云德，李晶莹，张佳慧，杜文明，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11