一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法及其应用，在骆驼刺泛菌已有的促作物抗干旱功能基础上，通过独特的GREACE诱变筛选技术，获得了一株既能促作物抗干旱，又可以抗高盐胁迫的骆驼刺泛菌突变株。GREACE诱变筛选技术不同于传统的先诱变再筛选的方法，首先通过诱变PCR获得大量变异的骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段。然后通过构建载体将这些突变片段导入野生型骆驼刺泛菌，获得DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因表达文库，进而利用逐步提高NaCl浓度的高盐胁迫环境定向筛选获得耐受高盐的骆驼刺泛菌突变株。

Screening method and application of a strain of PA11ZM1 strain of camel thorn

The invention discloses a screening method and application of PA11ZM1, a mutant strain of Camel stinger pandemic fungus. On the basis of the existing drought-promoting function of Camel stinger pandemic fungus and the unique GREACE mutation screening technology, a camel stinger pandemic fungus mutant strain which can promote crop drought resistance and resist high salt stress is obtained. GREACE mutagenesis screening technology is different from the traditional method of first mutagenesis and then screening. First, a large number of mutated DNA polymerase III delta subunit gene fragments were obtained by mutagenesis PCR. Then these mutant fragments were transfected into wild-type Pantotrichum Camelus by constructing vector to obtain DNA polymerase III delta subunit mutant gene expression library, and then targeted screening of high-salt tolerant Pantotrichum Camelus mutants was obtained by gradually increasing NaCl concentration under high salt stress environment.

【技术实现步骤摘要】
一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法及其应用
本专利技术属于微生物
，涉及利用GREACE法诱变筛选技术，具体地说，涉及一株GREACE法诱变筛选得到的耐受高盐环境的骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法及其应用。
技术介绍
众所周知，我国是一个农业大国，粮食生产在我国有着举足轻重的地位，但是水资源短缺、土壤盐碱化，高温、洪涝、低温冻害等极端天气都对粮食生产带来了巨大的威胁。因此，如何提高作物抗逆性一直是农业生产的热门话题。植物内生菌是存在于植物内部与植物密不可分的一类微生物。随着研究的不断深入,人们在内生菌活性物质的研究、内生菌与宿主的关系等方面取得了新的进展,近年来的研究表明，一些植物组织中存在的内生菌在宿主植物抵御外界不良环境胁迫的过程中发挥着重要作用。干旱是影响植物生长发育和产量至关重要的非生物胁迫因素之一，在许多植物中存在的植物内生菌和植物的共生以及相互作用能显著提高植物对干旱胁迫的抵抗能力。因此，筛选得到优秀的植物内生菌一直是近年来的热门课题。除了自然筛选得到的优秀菌株之外，在筛选得到的优秀内生菌基础上，对内生菌进行改造和定向进化，使内生菌获得除本身特性之外的新抗逆性，从而获得具有多种抗逆性的优秀菌株。干旱缺水地区的作物往往也存在高盐胁迫的环境，这种在已分离内生菌的基础上，获得既可以帮助植物抗旱，又耐受高盐环境的内生菌，对于干旱缺水地区的农业生产具有重大意义。
技术实现思路
专利技术的目的在于提供一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法及其应用，在分离筛选得到的一株具有促作物抗干旱功能的骆驼刺泛菌突变株(Pantoeaalhagi)的基础上，利用GREACE(Genomereplicationengineeringassistedcontinuousevolution)技术定向诱变筛选获得一株具有促作物抗干旱功能，且耐受高盐环境的骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1。其技术方案如下：一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法，包括以下步骤：1)通过基因比对获得PantoeaalhagiLTYR-11ZDNA聚合酶Ⅲ的δ亚基基因序列，利用易错PCR，获得大量随机突变的PantoeaalhagiLTYR-11ZDNA聚合酶Ⅲ的δ亚基基因片段；2)利用获得的突变的PantoeaalhagiLTYR-11ZDNA聚合酶Ⅲ的δ亚基基因片段，与表达载体连接，构建包含DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因的突变质粒文库；3)将得到的突变质粒文库转化进入PantoeaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，利用westernblot检测突变PantoeaalhagiLTYR-11ZDNA聚合酶Ⅲδ亚基基因的表达；4)上述菌株具有易诱变性与高突变率的特性；在此条件下，以5％NaCl浓度的LB液体培养基为基础，通过人工干预，逐步提高上述菌株培养环境NaCl浓度，通过连续的定向进化，获得耐受9％NaCl浓度的高盐LB培养基的PantoeaalhagiLTYR-11Z突变体PA11ZM1。本专利技术所述的骆驼刺泛菌突变株在促作物抗干旱且耐受高盐环境中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术在骆驼刺泛菌已有的促作物抗干旱功能基础上，本专利技术通过独特的GREACE诱变筛选技术，获得了一株既能促作物抗干旱，又可以抗高盐胁迫的骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1。GREACE诱变筛选技术(Genomereplicationengineeringassistedcontinuousevolution)不同于传统的“先诱变再筛选”的方法，是一种独特的定向进化筛选突变株的方法。以“诱变的同时筛选”为原则，首先通过诱变PCR，获得变异的骆驼刺泛菌突变株DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段。通过构建载体将该片段导入野生型骆驼刺泛菌突变株，筛选获取得DNA聚合酶Ⅲ复制修复机制缺陷的突变体库。该突变体库具有易诱变性与高突变率的特性。在人工提供的高盐胁迫的环境下，可连续，高效的筛选获得抗高盐耐受的骆驼刺泛菌突变株。附图说明图1是通过GREACE诱变筛选技术，定向进化得到高盐耐受的ErwiniaalhagiLTYR-11Z突变株的基本方法流程图；图2是Westernblot检测突变DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因的表达结果，第2、5泳道为带有突变DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因质粒的菌株，第3、6泳道为带有空质粒的菌株；图3是在9％NaCl浓度的高盐固体LB平板培养基中，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与GREACE诱变筛选的ErwiniaalhagiLTYR-11Z高颜耐受突变株生长状态比较；图4是在9％NaCl浓度的高盐LB液体培养基中，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与GREACE诱变筛选的ErwiniaalhagiLTYR-11Z高颜耐受突变株生长状态比较；图5是在9％NaCl浓度的高盐LB液体培养基中，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与GREACE诱变筛选的ErwiniaalhagiLTYR-11Z高颜耐受突变株生长曲线比较；图6是在15％与20％NaCl浓度的高盐LB液体培养基中，胁迫1小时条件下，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与GREACE诱变筛选的ErwiniaalhagiLTYR-11Z高颜耐受突变株存活率比较；图6A为15％NaCl浓度下胁迫1小时下，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与GREACE诱变筛选的ErwiniaalhagiLTYR-11Z高盐耐受突变株存活率差异；图6B为20％NaCl浓度下胁迫1小时下，ErwiniaalhagiLTYR-11Z野生型菌株，与高盐耐受突变株的存活率差异。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。本专利技术所述的GREACE诱变筛选技术的对象菌株，是从我国新疆荒漠地区采集的骆驼刺叶部组织分离获得的内生细菌，名称为骆驼刺泛菌(PantoeaalhagiLTYR-11Z)。本专利技术所述GREACE诱变筛选技术获得高盐耐受突变株PA11ZM1，具体操作方法如下：1)通过基因比对获得骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因序列，利用易错PCR，获得大量随机突变的骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段；2)利用获得的突变的骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段，与表达载体连接，构建包含骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因的突变质粒文库，通过挑取部分单菌落提质粒测序，确定通过易错PCR确实获得了包含DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因的质粒文库；3)将得到的突变质粒文库转化进入骆驼刺泛菌野生株，利用Westernblot检测突变DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因的表达，如图2所示，第2、5泳道为带有突变DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因质粒的菌株，第3、6泳道为带有空质粒的菌株，可以检测到突变的DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因表达，说明突变后DNA聚合酶Ⅲδ亚基可以在骆驼刺泛菌中正常表达；4)上述菌株具有易诱变性与高突变率的特性。在此条件下，如图1所示，以5％NaCl浓度的LB液体培养基为基础，接含突变质粒的骆驼刺泛菌单菌落于5ml5％NaCl浓度LB液体培养基中，30℃摇床200rpm培养16h，转接50ul至5ml5.5％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过基因比对获得骆驼刺泛菌PantoeaalhagiLTYR‑11Z的DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因序列，利用易错PCR，获得大量随机突变的DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段；2)利用获得的突变的骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段，与表达载体连接，构建包含骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因的突变质粒文库；3)将得到的突变质粒文库转化进入骆驼刺泛菌野生型菌株，利用Western blot检测突变骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因的表达；4)上述菌株具有易诱变性与高突变率的特性；在此条件下，以5％NaCl浓度的LB液体培养基为基础，通过人工干预，逐步提高上述菌株培养环境NaCl浓度，通过连续的定向进化，获得耐受9％NaCl浓度的高盐LB培养基的骆驼刺泛菌突变体PA11ZM1。

【技术特征摘要】
1.一株骆驼刺泛菌突变株PA11ZM1的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过基因比对获得骆驼刺泛菌PantoeaalhagiLTYR-11Z的DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因序列，利用易错PCR，获得大量随机突变的DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段；2)利用获得的突变的骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基基因片段，与表达载体连接，构建包含骆驼刺泛菌DNA聚合酶Ⅲδ亚基突变基因的突变质粒文库；3)将得到的突变质粒文库转化进入骆驼刺...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈锡辉，李书宇，张磊，王瑶，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61