重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及工业生物技术领域，公开了一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，包括发酵罐、营养盐补料瓶和控制柜，所述发酵罐中注有毕赤酵母发酵液，所述营养盐补料瓶通过补料泵连通至发酵罐，所述发酵罐内设置活细胞电极，所述控制柜连接所述补料泵和活细胞电极，所述控制柜根据活细胞电极传回的电导率数据控制所述补料泵补料。本发明专利技术还公开了毕赤酵母培养的方法，包括甘油批培养、甘油流加培养和甲醇诱导。本发明专利技术通过活细胞电极实时监控培养基的营养盐浓度，使毕赤酵母G/GMH1处于最优的生产状态，从而提高菌体表达葡萄糖氧化酶的表达效率。

Recombinant Pichia pastoris expressing glucose oxidase fermentation device and fermentation culture method

The invention relates to the field of industrial biotechnology, and discloses a fermentation device for recombinant Pichia pastoris expressing glucose oxidase, which comprises a fermentation tank, a nutrient feeding bottle and a control cabinet. The fermentation tank is filled with Pichia pastoris fermentation liquid, and the nutrient feeding bottle is connected to the fermentation tank through a feeding pump, and the fermentation tank is arranged in the fermentation tank. The control cabinet connects the feeding pump and the living cell electrode, and the control cabinet controls the feeding pump according to the conductivity data returned by the living cell electrode. The invention also discloses a method for culturing Pichia pastoris, including batch culture of glycerol, fed-batch culture of glycerol and induction of methanol. The method can monitor the nutrient concentration of the culture medium in real time by a living cell electrode, so that Pichia pastoris G/GMH1 is in the optimal production state, thereby improving the expression efficiency of glucose oxidase expressed by the bacteria.

【技术实现步骤摘要】
重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法
本专利技术涉及工业生物
，具体涉及的是一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法。
技术介绍
目前毕赤酵母G/GMH1发酵过程中营养盐采用一次性补加，容易导致盐浓度过高或过低，不利于菌体生长，无法实时在线监测营养盐变化情况，无法对补加营养盐及时调控。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法，通过活细胞电极实时监控培养基的营养盐浓度，使毕赤酵母G/GMH1处于最优的生产状态，从而提高菌体表达葡萄糖氧化酶的表达效率。本专利技术采取的技术方案是：一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征是，包括发酵罐、营养盐补料瓶和控制柜，所述发酵罐中注有毕赤酵母发酵液，所述营养盐补料瓶通过补料泵连通至发酵罐，所述发酵罐内设置活细胞电极，所述控制柜连接所述补料泵和活细胞电极，所述控制柜根据活细胞电极传回的电导率数据控制所述补料泵补料。进一步，所述控制柜控制补料泵补料的过程是通过控制补料泵的转速实现的。进一步，所述发酵罐中设置搅拌器。一种应用上述的重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置进行毕赤酵母培养的方法，其特征是，在所述发酵罐中对毕赤酵母培养基进行培养，包括如下步骤：(1)甘油批培养，通气比控制在5vvm，搅拌转速控制在700rpm；(2)甘油流加培养，通过控制甘油补加速率，使DO维持在5％-10％之间，当菌浓达到诱导的菌浓后，停止补加甘油，待DO再次上升，饥饿培养1h；(3)甲醇诱导，诱导前期缓慢流加甲醇，待菌体生长稳定后，流加麦芽糖溶液和纯甲醇，同时通过所述发酵液装置的控制营养盐的流加，使发酵液的电导率为8或10ms/cm。进一步，在甲醇诱导阶段，控制一定比例的流速，使流加入的麦芽糖摩尔数和甲醇的摩尔数比为1/20。进一步，甘油批培养阶段和甘油流加培养阶段温度设定在30℃，甲醇诱导阶段温度设定在22℃。进一步，发酵罐中培养液的PH值为5.5。进一步，所述的成分包括40g/L甘油，18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。进一步，甘油流加阶段的甘油补料为50％重量体积比的甘油，使用时补加1.2％的PTM1；甲醇诱导阶段的甲醇补料为100％甲醇，使用时补加1.2％的PTM1。进一步，补料的营养盐包括18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。本专利技术的有益效果是：优化了毕赤酵母G/GMH1发酵培养工艺，实现在线反馈控制营养盐流加，提高了细胞代谢活性，促进了产物的表达。与对照组相比，维持电导率(营养盐浓度)为10ms/cm时，菌浓DCW和葡萄糖氧化酶的表达量分别提高了23.5％和24.1％。附图说明附图1是本专利技术的培养装置的结构示意图；附图2是发酵过程电导率变化曲线图；附图3是不同电导率对菌体生长的影响曲线图；附图4是不同电导率对GOD产量的影响曲线图；附图5是不同电导率对单位菌体GOD的影响曲线图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置以及发酵培养方法的具体实施方式作详细说明。参见附图1，重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置包括发酵罐1、营养盐补料瓶2和控制柜3，发酵罐1中注有毕赤酵母发酵基液，发酵罐1中设置搅拌器4，营养盐补料瓶2通过补料泵5连通至发酵罐1，发酵罐1内设置活细胞电极6，控制柜3连接补料泵5和活细胞电极6，控制柜3根据活细胞电极传6回的电导率数据控制补料泵5的转速进行补料，发酵基液的电导率是通过改变营养盐的浓度实现的。重组毕赤酵母G/GMH1在50L反应器内发酵过程中，主要分为三个阶段：甘油批培养阶段、甘油流加培养阶段、甲醇诱导阶段；在批培养阶段，通气比控制在5vvm，搅拌转速控制在700rpm，在批培养结束后，细胞摄氧率(OxygenUptakeRate，OUR)，二氧化碳释放率(CarbonDioxideReleaseRate，CER)下降，溶解氧(DO)上升，开始流加甘油培养，通过控制甘油补加速率，使DO维持在5％-10％之间，当菌浓达到诱导的菌浓后，停止补加甘油，待DO再次上升，饥饿培养1h后，开始流加甲醇诱导，诱导前期缓慢流加甲醇，带菌体生长稳定后，流加1/20摩尔比的麦芽糖/甲醇混合溶液，同时，采用活细胞电极在线检测反馈营养盐的流加，使电导率维持在10ms/cm，8ms/cm的水平。整个过程控制补加氨水维持pH在5.5左右，甘油批培养阶段和甘油流加培养阶段温度设定在30℃，诱导阶段温度设定在22℃。本专利技术的菌种为毕赤酵母重组菌G/GMH1，以G/GODM(GS115,Mut+,god)为出发菌株，AOX1启动子调控HAC1基因表达的重组毕赤酵母。培养基为BSM(Basalsaltsmedium)发酵培养基，包含40g/L甘油，18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。甘油补料为50％(w/v)甘油，使用时补加1.2％的PTM1。甲醇补料为100％甲醇，使用时补加1.2％的PTM1。营养盐补料包含18g/L硫酸钾，4.13g/L氢氧化钾，14.99g/L硫酸镁，27mL/L磷酸，0.93g/L硫酸钙。其中微量元素PTM1(tracemineralsolution)包括0.09g/LKI，6g/LCuSO4·5H2O，3g/LMnSO4·H2O，0.2g/LMoNa2O4·2H2O，0.02g/LH3BO3，20g/LZnCl2，0.5g/LCoCl2，65g/LFeSO4·7H2O，0.2g/L生物素，5mL/LH2SO4。在培养过程中，对菌浓的测定方法如下：取发酵液，稀释到一定的倍数，然后在波长为600nm处时，测定OD600＝OD读数×稀释倍数n；根据测定得到的OD600和菌体干重的关系：DCW(g/L)＝0.24×OD600+1.23(R2＝0.994)，计算菌体干重(Drycellweigh,DCW)。对GOD测定方法如下：发酵液处理：将发酵液在12000rpm条件下离心5min，转移发酵上清液到1.5mL的EP管中，测定GOD。GOD酶活测定：在10mL离心管中依次加入2.5mL的0.21mM的邻联茴香胺，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U/mL的辣根过氧化物酶，37℃保温5min后，向离心管中加入V0酶液；每隔30秒记录一次OD500，此时，GOD酶活(U/mL)＝(△OD500/△t)max/7.5×V/V0×n；V为反应总体积，V0为加入粗酶体积，n为稀释倍数。经过实验，参见附图2，在重组毕赤酵母甘油流加培养的菌体生长阶段(0h之前为甘油培养阶段电导率变化)，随着菌体的快速增长，培养基中的营养盐快速消耗，当菌体浓度达到43g/L，发酵液电导率从初始的21ms/cm降低到8ms/cm左右。为了优化营养盐补加策略，本研究根据电导率测量值反馈控制营养盐的补加速率，将电导率分别维持在10ms/cm，8ms/cm的水平，以正常不补加营养盐的工艺作为对照，考察营养盐浓度对重组菌生长和产物合成的影响。参见附图3，维持不同的电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征在于：包括发酵罐、营养盐补料瓶和控制柜，所述发酵罐中注有毕赤酵母发酵液，所述营养盐补料瓶通过补料泵连通至发酵罐，所述发酵罐内设置活细胞电极，所述控制柜连接所述补料泵和活细胞电极，所述控制柜根据活细胞电极传回的电导率数据控制所述补料泵补料。

【技术特征摘要】
1.一种重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征在于：包括发酵罐、营养盐补料瓶和控制柜，所述发酵罐中注有毕赤酵母发酵液，所述营养盐补料瓶通过补料泵连通至发酵罐，所述发酵罐内设置活细胞电极，所述控制柜连接所述补料泵和活细胞电极，所述控制柜根据活细胞电极传回的电导率数据控制所述补料泵补料。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征在于：所述控制柜控制补料泵补料的过程是通过控制补料泵的转速实现的。3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置，其特征在于：所述发酵罐中设置搅拌器。4.一种应用如权利要求1至3中任一项所述的重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵装置进行毕赤酵母培养的方法，其特征在于：在所述发酵罐中对毕赤酵母培养基进行培养，包括如下步骤：(1)甘油批培养，通气比控制在5vvm，搅拌转速控制在700rpm；(2)甘油流加培养，通过控制甘油补加速率，使DO维持在5％-10％之间，当菌浓达到诱导的菌浓后，停止补加甘油，待DO再次上升，饥饿培养1h；(3)甲醇诱导，诱导前期缓慢流加甲醇，待菌体生长稳定后，流加麦芽糖溶液和纯甲醇，同时通过所述发酵液装置的控制营养盐的流...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱江潮，吴凡，王泽建，张文玉，庄英萍，储炬，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31