环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了环‑L‑谷氨酸‑L‑亮氨酸及其应用。本发明专利技术提供了一种新的环二肽——环‑L‑谷氨酸‑L‑亮氨酸(cyclo‑L‑Glu‑L‑Lue)，分子量为242，该物质能显著促进植物生长，当使用浓度为100nmol/L时，约0.024ppm，能显著促进植物根系生长，促生率达到37％。本发明专利技术所述的环二肽能够在促进植物生长中应用。

Cyclic -L- glutamic acid -L- leucine and its application

The invention discloses L L glutamic acid, leucine and its application. The present invention provides a new cyclic dipeptide, cyclo L glutamic acid L leucine (cyclo L Glu L Lue), with molecular weight 242. The substance can significantly promote plant growth. When the concentration is 100 nmol/L, about 0.024 ppm, it can significantly promote plant root growth, and the growth rate is 37%. The loop two peptide of the invention can be applied in promoting plant growth.

【技术实现步骤摘要】
环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用
本专利技术属于植物生长调节剂和生物农药领域，涉及环-L-谷氨酸-L-亮氨酸及其应用。
技术介绍
环二肽(2,5-diketopiperazines,DKPs)及其衍生物具有抗细菌、真菌、病毒的功能，有些环二肽还能促进植物生长。如铜绿假单胞菌PAO1菌株产生的3种环二肽就具有促生活性。有一些种类的环二肽及其衍生物还能作为一种群体感应的新的信号分子，能与LuxR类蛋白互作，从而参与细菌种间甚至不同种生物间的信号传导，调控相关基因表达。LactobacillusreuteriRC-14产生的2种环二肽能作用于金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)MN8菌株的QS系统，从而抑制其致病性。假单胞菌株PAO1产生3种环二肽也具有QS信号分子的功能。环二肽及其衍生物由于具有多种生物学活性，并且其环状结构的稳定性，这类物质已经成为了新药创制的重要研究对象。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的环二肽。本专利技术的另一目的是提供该环二肽的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种新的环二肽，为环-L-谷氨酸-L-亮氨酸，结构如图3所示。所述的环二肽，分子量为242。本专利技术所述的环二肽在促进植物生长中的应用。本专利技术所述的环二肽优选在促进植物根系生长中的应用。本专利技术所述的环二肽在制备植物生长调节剂中的应用。本专利技术所述的环二肽优选在制备促进植物根系生长的生长调节剂中的应用。所述的植物根系生长调节剂中本专利技术所述的环二肽的浓度优选75-100nmol/L，进一步优选100nmol/L。有益效果：本专利技术提供了一种新的环二肽——环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue)，分子量为242，该物质能显著促进植物生长，当使用浓度为100nmol/L时，约0.024ppm，能显著促进植物根系生长，促生率达到37％。附图说明图1大肠杆菌表达环-L-谷氨酸-L-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.A:表达载体的结构图；B：SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白.图2HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌产生的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸A:HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌合成产物(黑色：空载体pET28a；红色：pET28a+PFL_1389)；B:差异峰处的物质的M/Z值.图3MS2鉴定产物的结构A:MS2分析纯化产物的裂解谱带；B:环-L-谷氨酸-L-亮氨酸的结构式(cyclo-L-Glu-L-Lue,cEL)以及裂解部位.图4环-L-谷氨酸-L-亮氨酸促进烟草根系生长的效果检测.具体实施方式实施例1大肠杆菌表达环-L-谷氨酸-L-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.以生防假单胞菌Pf-5菌株(购自ATCC，编号为ATCCBAA-477)的基因组为模板，扩增环二肽合成酶编码基因(SEQIDNO:1)，表达环二肽合成酶(SEQIDNO:2)，扩增引物为CDPS-FP(SEQIDNO:3)和CDPS-RP(SEQIDNO:4)，引物的两端分别引入NdeI和HindIII酶切位点，回收PCR产物，再将PCR产物用NdeI和HindIII双酶切后，克隆到pET28a(+)的相同的酶切位点，再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，测序正确后，得到含有重组载体pET28/PFL_1389(图1A)的BL21(DE3)工程菌株。将上步构建的工程菌株接种到终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养，当OD600达到0.5左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在18℃条件下继续培养12小时后，离心收集菌体。得到的菌体用结合缓冲液(20mmol/LK2PO4,500mmol/LNaCl,and20mmol/Limidazole,5％甘油，pH7.4)悬浮之后，用超声波进行破碎。然后，离心后的上清过HisTrapHP柱，然后用含有10-500mM咪唑的洗脱液(20mmol/LK2PO4,500mmol/LNaCl,and10-500mmol/Limidazole,5％甘油，pH7.4)进行浓度梯度洗脱，收集不同咪唑浓度洗脱液组份，利用SDS-PAGE进行检测。最后，利用分子筛柱子Hiload16/60superdex200进一步纯化，将得到洗脱组份用SDS-PAGE进行检测(图1B)。实施例2HPLC-MS检测大肠杆菌工程菌产生的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸用终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基活化含有pET28/PFL_1389重组载体的BL21(DE3)工程菌株，以转pET28空载体的大肠杆菌BL21(DE3)(pET28)为对照。按照1％的接种量，转接到终浓度为50μg/ml卡那霉素的M9培养基中，37℃，200rpm培养，当OD600达到0.5左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在18℃条件下继续培养36h，培养液在10000rpm下离心30min，上清用0.22μm水系滤膜过滤，滤液进行HPLC-MS检测，检测波长为214nm。如图2A所示，红色的线为BL21(DE3)(pET28/PFL_1389)，黑色的线为对照BL21(DE3)(pET28)，由图可知差异峰值出现在26.5min时(图2A)，表明在工程菌株中出现了不同的物质。在该差异峰值下存在五种物质，其中m/z为243.1的物质是主要成份(图2B)。实施例3MS2鉴定产物的结构采用上述同样的方法用M9培养基发酵BL21(DE3)(pET28/PFL_1389)工程菌株。利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂，用80％的甲醇溶液溶解，再过0.22μm的滤膜，在利用制备级HPLC进行纯化，使用的纯化柱为Macherey-Nagel公司的VP250/21NucleodurC18Htec5μm，流动相A含0.1％三氟乙酸的去离子水，流动相B为含0.1％三氟乙酸的乙腈。纯化过程如下：0-2分钟，5％的流动相B；2-25分钟，50％的流动相B；25-35分钟，95％的流动相B；35-39分钟，5％的流动相B；39-45分钟，5％的流动相B.流速为16ml/min。收集各组分，并进行MS检测，将检测m/z为243.1的洗脱组份，先冷冻抽干，再称重，取少量样品，溶解到甲醇中，进行MS2检测。图3A物质的m/z为243.1的MS2图谱。根据环二肽的分子量数据库，结合MS2谱带推测该物质的结构式为环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue,cEL)。实施例4环-L-谷氨酸-L-亮氨酸促进烟草根系生长的效果检测采用平板促生发法检测纯化的环-L-谷氨酸-L-亮氨酸的促生活性，将该环二肽配置成不同浓度，浸种处理烟草种子，避光处理12个小时，用30％NaClO消毒20分钟，再用灭菌水冲洗3遍，用灭菌的牙签将种子挑到方形培养皿(含有MS固体培养基)中，每个培养皿放11颗种子，然后置于光照培养箱中培养，光照培养箱白天25℃，16h；黑夜，22℃，8h。两周后测量并记录根长。结果(图4)表明，环-L-谷氨酸-L-亮氨酸(cyclo-L-Glu-L-Lue)，能显著促进植物生长，当使用浓度为100nmol/L时，约0.024ppm，效果最佳，促生率达到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新的环二肽，其特征在于为环‑L‑谷氨酸‑L‑亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种新的环二肽，其特征在于为环-L-谷氨酸-L-亮氨酸。2.根据权利要求1所述的环二肽，其特征在于分子量为242。3.权利要求1所述的环二肽在促进植物生长中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求1所述的环二肽在促进植物根系生长中的应用。5.权利要求1所述的环二肽制备植物生长调节剂中的应用。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：高学文，伍辉军，袁启明，杨洋，吴黎明，顾沁，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32