确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法技术

本发明专利技术公开了确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法，其包括以下步骤：分别获得同一林木个体的维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA；分别针对所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA，进行cDNA文库构建及测序；基于测序结果进行lncRNA预测和注释；基于所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA表达量，进行组织特异性表达分析，以便确定具有组织特异性的lncRNA；将所述具有组织特异性的lncRNA进行序列元件motif预测，以便确定具有组织特异性的lncRNA的motif；以及对具有组织特异性的lncRNA的motif进行功能分析。利用该方法能够有效确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能，对于进一步挖掘lncRNA在林木次生生长过程中的调控作用意义重大。

Methods for determining key lncRNA and its functions in secondary growth of forest trees

The invention discloses a method for determining the key lncRNA and its function in the secondary growth process of forest trees, which comprises the following steps: obtaining the total RNA of vascular cambium, immature xylem and mature xylem of the same tree individual, and feeding the total RNA of the vascular cambium, immature xylem and mature xylem respectively. Construction and sequencing of a cDNA library; prediction and annotation of lncRNA based on sequencing results; tissue-specific expression analysis based on the expression of lncRNA in the vascular cambium, immature xylem and mature xylem to determine tissue-specific lncRNA; sequencing of the tissue-specific lncRNA Elemental motif prediction is used to determine the motif of tissue-specific lncRNA and functional analysis of motif of tissue-specific lncRNA. This method can effectively determine the key lncRNA and its function in the secondary growth process of trees, and it is of great significance to further explore the regulatory role of lncRNA in the secondary growth process of trees.

【技术实现步骤摘要】
确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法
本专利技术涉及遗传学领域，具体涉及lncRNA功能研究，更具体地，涉及确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法。
技术介绍
林木由于其普遍存在的次生生长而区别于草本植物，具有分布广、生命周期长等特征，现已成为全球最为重要的可再生生物质能源之一。因此，研究林木的次生生长过程意义重大。已有的研究结果也表明，林木次生生长是受多基因多组学下形成的复杂调控网络所调控的。然而，目前对于林木的次生生长过程的研究，主要是通过分子和遗传的手段对参与林木的次生生长过程中一些重要的编码蛋白基因及转录因子展开的，较少见到从非编码蛋白基因角度研究林木次生生长过程的报道。因而，目前对于林木次生生长过程中的非编码蛋白基因(尤其是lncRNA)的研究仍有待加强。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种研究林木次生生长过程中的非编码蛋白基因调控作用的手段，尤其是确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法。首先，需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，LncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA分子(非编码蛋白基因)。据统计，哺乳动物蛋白编码基因占总RNA的1％，而长链非编码RNA占总RNA的比例可达4％～9％，这些长链非编码RNA现已成为继microRNA后的研究热点。大量研究表明，LncRNA能够参与生物体各种生命活动过程中，例如人类疾病、动物胚胎发育、植物逆境胁迫响应、植物开花等。随着高通量测序技术(如RNA-seq)的发展，越来越多的人类和动物中的lncRNA得以发现与鉴定。然而，在植物中有关lncRNA的研究还相对滞后；尤其在林木次生生长过程中的调控作用尚不清晰。专利技术人认为，目前关于lncRNA的功能研究，主要是从靶基因的角度，基于对lncRNA顺式和反式作用方式靶基因的预测、共表达分析和网络构建以及与miRNA的相互作用关系来进行的。也即，目前关于lncRNA的功能研究还处于初步、单一的阶段。而经过一系列的研究，基于lncRNA可通过自身具有的序列元件(motif)与DNA结合形成RNA-DNA复合体，从而实现lncRNA结构的重排及功能的行使，专利技术人认为，可以换个角度进行lncRNA的功能研究：从lncRNA中可能motif的预测及功能分析角度进一步探究lncRNA的作用机制。进而，专利技术人提出了一种确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法。其中，针对本文中所采用的表达方式“motif”：motif又称模体或模序，属于蛋白质的超二级结构，由2个或2个以上具有二级结构的的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，并发挥专一的功能。一种类型的模体总有其特征性的氨基酸序列。模体是刻画蛋白质家族组成结构和执行功能的重要部分。下面对该方法进行具体描述。在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：分别获得同一林木个体的维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA；分别针对所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA，进行cDNA文库构建及测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，进行lncRNA预测和注释，以便分别获得所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA数量、表达量等注释信息；基于所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA表达量，进行组织特异性表达分析，以便确定具有组织特异性的lncRNA，所述具有组织特异性的lncRNA即为所述林木次生生长过程中的关键lncRNA；将所述具有组织特异性的lncRNA进行序列元件motif预测，以便确定所述具有组织特异性的lncRNA的motif；以及对所述具有组织特异性的lncRNA的motif进行功能分析，以便确定所述林木次生生长过程中关键lncRNA的功能。本专利技术的方法，通过对形成层、未成熟木质部及成熟木质部中特异性表达lncRNA的序列motif的预测及功能分析，能够有效确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能，对于进一步挖掘lncRNA在林木次生生长过程中的调控作用意义重大。换言之，根据本专利技术的实施例，本专利技术提供了一种有效的挖掘林木次生生长过程中关键lncRNA的分析方法。并且，需要强调的是，本专利技术的方法，通过对杨树形成层、未成熟木质部及成熟木质部中特异性表达lncRNA的高通量筛选及其序列元件的预测与功能分析，为lncRNA作用机制研究提供了一种新思路。并且，从序列元件预测和功能分析角度挖掘的lncRNA功能，可以与从靶基因挖掘的相应lncRNA的功能互为补充、印证，从而能够使研究者更全面地了解lncRNA的作用机制，对于整个遗传学领域的研究将产生重大意义。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术实施例的确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法的流程示意图；图2显示了根据本专利技术的实施例，毛白杨维管形成层、未成熟木质部及成熟木质部中特异性表达lncRNA的表达热图；图3显示了根据本专利技术的实施例，毛白杨维管形成层、未成熟木质部及成熟木质部中特异性表达lncRNA的motif及其功能富集分析结果。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：分别获得同一林木个体的维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA；分别针对所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA，进行cDNA文库构建及测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，进行lncRNA预测和注释，以便分别获得所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA数量、表达量等注释信息；基于所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA表达量，进行组织特异性表达分析，以便确定具有组织特异性的lncRNA，所述具有组织特异性的lncRNA即为所述林木次生生长过程中的关键lncRNA；将所述具有组织特异性的lncRNA进行序列元件motif预测，以便确定所述具有组织特异性的lncRNA的motif；以及对所述具有组织特异性的lncRNA的motif进行功能分析，以便确定所述林木次生生长过程中关键lncRNA的功能。根据本专利技术的实施例，利用本专利技术的方法，能够有效确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能，对于进一步挖掘lncRNA在林木次生生长过程中的调控作用意义重大。其中，需要说明的是，维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA的获得方法不受特别限制，例如可以自行采集组织样品然后再提取总RNA。其中，采集组织样品的方法也不受特别限制，只要按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：分别获得同一林木个体的维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA；分别针对所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA，进行cDNA文库构建及测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，进行lncRNA预测和注释，以便分别获得所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA数量、表达量等注释信息；基于所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA表达量，进行组织特异性表达分析，以便确定具有组织特异性的lncRNA，所述具有组织特异性的lncRNA即为所述林木次生生长过程中的关键lncRNA；将所述具有组织特异性的lncRNA进行序列元件motif预测，以便确定所述具有组织特异性的lncRNA的motif；以及对所述具有组织特异性的lncRNA的motif进行功能分析，以便确定所述林木次生生长过程中关键lncRNA的功能。

【技术特征摘要】
1.一种确定林木次生生长过程中关键lncRNA及其功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：分别获得同一林木个体的维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA；分别针对所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的总RNA，进行cDNA文库构建及测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，进行lncRNA预测和注释，以便分别获得所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA数量、表达量等注释信息；基于所述维管形成层、未成熟木质部和成熟木质部的lncRNA表达量，进行组织特异性表达分析，以便确定具有组织特异性的lncRNA，所述具有组织特异性的lncRNA即为所述林木次生生长过程中的关键lncRNA；将所述具有组织特异性的lncRNA进行序列元件motif预测，以便确定所述具有组织特异性的lncRNA的motif；以及对所述具有组织特异性的lncRNA的motif进行功能分析，以便确定所述林木次生生长过程中关键lncRNA的功能。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行lncRNA预测和注释之前，进一步包括对所述测序结果进行预处理的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理包括：(1)去除总体质量偏低的测序读段：将质量大于20碱基所占比例小于50％的测序读段去除；(2)去除3’端质量Q低于10的碱基，其中，Q＝-10log(error_ratio)；(3)去除测序读段中所含有的接头序列；(4)去除测序读段中含有的模糊的N碱基；(5)去除长度小于20bp的测序片段；(6)去除核糖体RNA，其中以所述林木的所有核糖体RNA作为比对模板，将比对上模板的测序读段作为核糖体RNA。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述lncRNA预测和注释包括：利用Tophat将所述测序结果比对到所述林木的基因组，以便获得经过比对的测序读...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德强，周大凌，杜庆章，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11