本发明专利技术公开了一种基于供体‑受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法。该方法包括如下步骤：(1)分别测量每个活细胞的EA、ED、DEST和AEST，并根据供体‑受体浓度比RDA＝DEST/AEST，将获得的每个活细胞的数据根据RDA的数值大小进行排序；(2)将排序后的RDA按等间隔划分区间；(3)分别计算各RDA区间内细胞数据EA、ED、DEST和AEST的平均值；(4)利用预处理后的数据计算自由供体浓度Dfree和自由受体浓度Afree，并用于朗格缪尔型FRET结合曲线的拟合分析。本发明专利技术方法极大地提高FRET双杂交检测分析的稳定性和分析结果的可靠性。
A method for pretreatment of FRET double hybrid detection data based on donor acceptor concentration ratio
The invention discloses a method for preprocessing FRET double hybrid detection data based on the donor to receptor ratio ratio. The method includes the following steps: (1) EA, ED, DEST and AST of each living cell were measured, and the data of each living cell were sorted according to the value of RDA according to the concentration ratio of donor to receptor RDA = DEST / AEST; (2) RDA was divided into equal intervals after sorting; (3) cells in each RDA interval were calculated separately. The average values of EA, ED, DEST and AEST were obtained. (4) The free donor concentration (Dfree) and free receptor concentration (Afree) were calculated using the pretreated data, and were used to fit the Langmuir FRET binding curve. The method of the invention greatly improves the stability of FRET double hybrid detection analysis and the reliability of the analysis result.
【技术实现步骤摘要】
一种基于供体-受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法
本专利技术属于荧光共振能量转移(FRET)检测
，特别涉及一种基于供体-受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法。
技术介绍
荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)是指两个荧光基团足够靠近时，处于激发态的供体荧光基团将能量以非辐射形式转给邻近受体荧光基团的过程。两个荧光基团间的FRET作用强弱通常采用二者间的FRET效率(E)来表征(ZalT,GascoigneNRJ.Photobleaching-correctedFRETefficiencyimagingoflivecells[J].Biophysicaljournal,2004,6(6):3923-3939)。基于荧光蛋白(Fluorescentproteins,FPs)的FRET显微术已广泛应用于研究活细胞中蛋白质间的相互作用。以受体为中心的FRET效率(EA)可以通过33-FRET等方法测量，以供体为中心的FRET效率(ED)可以通过E-FRET等方法测量。FRET双杂交检测技术则结合了33-FRET和E-FRET两种定量检测方法，通过同时测量生物复合体中供体受体间的最大EA和ED来确定复合体中两种分子的结合比例(ButzES,Ben-JohnyM,ShenM,etal.QuantifyingmacromolecularinteractionsinlivingcellsusingFRETtwo-hybridassays[J].Natureprotocols,2016,11(12):2470-2498)。FRET双杂交检测技术通过同时测量大量活细胞中标记靶蛋白的供体蛋白和受体蛋白分子之间的ED、EA以及对应细胞中自由供体分子浓度(Dfree)和自由受体分子浓度(Afree)，然后分别对ED-Afree和EA-Dfree数据按如下朗格缪尔(Langmuir)型方程：拟合得到最大的ED(ED,max,所有供体结合到受体时的ED)和最大的EA(EA,max，所有受体结合到供体的EA)以及表征供体受体间的解离常数(Kd,EFF)。图1给出了一个检测结果拟合示意图。复合分子中供体-受体结合比例(ND/NA)由EA,max/ED,max计算得到。如图1所示，FRET双杂交检测实验要求Dfree和Afree的范围比较大，同时测量值间隔比较分散。在进行E-FRET和33-FRET双杂交定量检测时，可以测量出每个细胞中供体-受体间的ED、EA以及每个细胞的总供体浓度(DEST)和总受体浓度(AEST)。DEST与AEST之比为供体-受体浓度比(RDA)。活细胞FRET双杂交实验需要共转染分别表达两个利用FPs标记靶蛋白的质粒，然后从一系列不同RDA的细胞中获得数据。在拟合分析之前，很难明确每个细胞RDA的高低，只能通过测量大量细胞以保证有足够多RDA不同的数据从而获得完整的结合曲线。实际测量中，有时RDA值相近的细胞很多，但它们的EA或ED却差别很大，而其他RDA值范围的细胞数据较少。图3a所示的数据中，RDA值较小且相近的细胞很多，而它们的EA或ED却差别很大，直接拟合这些细胞的测量数据会得到如图3b和3c所示的几乎没有弧度的拟合曲线，此时Kd,EFF接近于0，意味着两靶蛋白无论浓度比多少都完全结合在一起，这与实际不符。造成这种不真实拟合分析结果的原因主要是由于出现了大量RDA值相近且对应EA或ED偏差较大的测量数据。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于供体-受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法，从而提高FRET双杂交检测数据拟合分析的稳定性和可靠性。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于供体-受体浓度比(RDA)预处理FRET双杂交检测数据的方法，包括如下步骤：(1)利用FRET双杂交检测技术分别测量每个活细胞以受体为中心的FRET效率EA、以供体为中心的FRET效率ED、总供体浓度DEST和总受体浓度AEST，并获得供体-受体浓度比RDA＝DEST/AEST；再根据RDA的数值大小进行排序，获得RDA最小值与最大值；(2)划分区间：根据获得的RDA最小值与最大值形成的范围值，以RDA最小值为起点，按等间隔划分区间，得到等间隔的RDA区间；其中，划分的区间个数不少于25个；(3)数据预处理：分别计算各RDA区间内细胞数据EA、ED、DEST和AEST的平均值；(4)利用步骤(3)中预处理后的数据计算自由供体浓度Dfree和自由受体浓度Afree，得到基于供体-受体浓度比(RDA)预处理后的FRET双杂交检测数据。步骤(1)中所述的FRET双杂交检测为E-FRET和33-FRET双杂交定量检测。步骤(1)中所述的测量的活细胞个数至少为25个。步骤(1)中所述的活细胞为同时转染上供体标记质粒和受体标记质粒的活细胞。步骤(1)中所述的按数值大小进行排序可以按从小到大的顺序或按从大到小的顺序进行排序。步骤(2)中所述的划分区间优选为通过如下方法实现：观察RDA的密度分布，当RDA大多分布在0～1之间时，将RDA的区间间隔设为0.05，然后以RDA的最小值为起点，每增加0.05划分一个区间，每个区间包含RDA值处于该区间范围内的所有细胞数据(EA、ED、DEST和AEST)；当RDA大多分布在1以上时，将区间间隔设为0.2，其余步骤相同，区间的间隔可自行调整，但要使最终预处理后的数据量不少于25组。步骤(4)中所述的预处理后数据计算自由供体浓度Dfree和自由受体浓度Afree可用于朗格缪尔型FRET结合曲线的拟合分析。所述的朗格缪尔(Langmuir)型方程为：其中，EA,max为所有受体结合到供体时的EA；ED,max为所有供体结合到受体时的ED；Kd,EFF为供体-受体间的解离常数；ND/NA为供体-受体结合比例。本专利技术的基本原理如下：在同样的条件下，不同细胞的供体-受体浓度比(RDA)相同时，理论上EA和ED应该分别相等。但实际测量中由于各种测量误差，有时RDA相近的细胞EA或ED却相差很大。大量偏差较大的数据如果直接被用于计算Dfree和Afree并进行拟合分析可能会得到与事实不符的结果。在朗格缪尔型FRET结合曲线中，如果在曲线上升阶段出现了大量偏差较大的数据，拟合出的曲线将几乎垂直上升。使用本方法对FRET双杂交检测数据进行预处理可以极大地改善朗格缪尔型FRET拟合分析的稳定性和可靠性。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术的方法利用FRET双杂交检测技术测量得到的所有细胞的RDA，将RDA分成一定大小区间，并对每个区间内的测量数据ED、EA、总供体浓度(DEST)和总受体浓度(AEST)进行数据平均预处理，即预处理前是每个活细胞对应一组数据，预处理后是每个区间对应一组数据，每个区间分别得到一个EA、ED、DEST和AEST。采用预处理后的数据计算Dfree和Afree，进行朗格缪尔型FRET结合曲线的拟合分析。2、利用本专利技术的方法可以降低大量偏差较大的数据对拟合结果的影响，从而极大地提高FRET双杂交检测分析的稳定性和分析结果的可靠性。附图说明图1是朗格本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于供体‑受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用FRET双杂交检测技术分别测量每个活细胞以受体为中心的FRET效率EA、以供体为中心的FRET效率ED、总供体浓度DEST和总受体浓度AEST，并获得供体‑受体浓度比RDA＝DEST/AEST；再根据RDA的数值大小进行排序，获得RDA最小值与最大值；(2)划分区间：根据获得的RDA最小值与最大值形成的范围值，以RDA最小值为起点，按等间隔划分区间，得到等间隔的RDA区间；其中，划分的区间个数不少于25个；(3)数据预处理：分别计算各RDA区间内细胞数据EA、ED、DEST和AEST的平均值；(4)利用步骤(3)中预处理后的数据计算自由供体浓度Dfree和自由受体浓度Afree，得到基于供体‑受体浓度比预处理后的FRET双杂交检测数据。
【技术特征摘要】
1.一种基于供体-受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用FRET双杂交检测技术分别测量每个活细胞以受体为中心的FRET效率EA、以供体为中心的FRET效率ED、总供体浓度DEST和总受体浓度AEST，并获得供体-受体浓度比RDA＝DEST/AEST；再根据RDA的数值大小进行排序，获得RDA最小值与最大值；(2)划分区间：根据获得的RDA最小值与最大值形成的范围值，以RDA最小值为起点，按等间隔划分区间，得到等间隔的RDA区间；其中，划分的区间个数不少于25个；(3)数据预处理：分别计算各RDA区间内细胞数据EA、ED、DEST和AEST的平均值；(4)利用步骤(3)中预处理后的数据计算自由供体浓度Dfree和自由受体浓度Afree，得到基于供体-受体浓度比预处理后的FRET双杂交检测数据。2.根据权利要求1所述的基于供体-受体浓度比预处理FRET双杂交检测数据的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的划分区间通过如下方法实现：观察RDA的密度分布，当RDA大多分布...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈同生，麦子昊，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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