一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒技术

本发明专利技术提供一种基于无缝克隆技术的快速克隆载体、该载体的制备方法以及含有该载体的试剂盒。所述克隆载体的制备方法包括：PCR扩增获得目的基因，PCR产物的特征在于其两末端从外到里依次为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点上/下游15‑20bp的同源序列和同一限制性内切酶识别序列；采用TA克隆的方法构建重组质粒；经同一限制性内切酶切割，回收T载体大片段，采用T4DNA连接酶使其自连后构建了pWMU‑19T系列载体。本发明专利技术所述克隆载体相对TA克隆载体具有PCR产物无需加A反应，30min即可完成载体构建，无需蓝白斑筛选阳性克隆，且阳性克隆率大于90％，并可实现高通量构建的技术优势。

Cloning vector preparation method and kit based on seamless cloning technology

The invention provides a fast cloning carrier based on seamless cloning technology, a preparation method of the carrier and a reagent kit containing the carrier. The preparation method of the cloning vector comprises the following steps: PCR amplification obtains the target gene, and the PCR product is characterized by a single restriction endonuclease digestion site homologous sequence of 15_20 BP upstream/downstream and the same restriction endonuclease recognition sequence in a polyclonal site with an arbitrary E. coli expression vector at both ends from outside to inside; The recombinant plasmid was constructed by cloning A, and the large fragments of T vector were recovered by cleavage with the same restriction enzyme. The pWMU_19T series vectors were constructed by using T4 DNA ligase. Compared with TA cloning vector, the cloning vector of the invention has the advantages of not adding A reaction to PCR products, 30 minutes to complete vector construction, no blue and white spot screening positive clones, and the positive cloning rate is more than 90%, and high throughput construction can be realized.

【技术实现步骤摘要】
一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒
本专利技术涉及一种基于无缝克隆技术的克隆载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制备方法以及含有该载体的试剂盒的具体实施方案，属于基因工程领域。
技术介绍
克隆载体是开展基因保存、扩增、测序、表达及其体外转录与翻译等分析操作最普遍使用的工具之一，而T载体是目前克隆PCR产物最常用的克隆载体，该载体的应用是基于T-A克隆技术，其原理是在PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性，可向PCR扩增产物的3′末端添加一个突出的A碱基，因此可以和3′末端具有单个T碱基尾巴的T载体互补配对连接构建重组克隆质粒。目前最常用的T载体主要来源于商业化产品，其制备方法可分为三大类：(1)采用产生平末端的EcoRV等内切酶将环状克隆载体切割成线性载体，然后利用末端转移酶或Taq酶，以ddTTP或dTTP为底物，在线性载体的3′末端添加单个T碱基(ZhouMYandGomez-SanchezCE.UniversalTAcloning.Currentissuesinmolecularbiology.2000,2:1-7)；(2)在前T载体的多克隆位点中引入特定限制性内切酶(比如XcmI、AhdI)酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3′末端具有单个T碱基突出的线性化T载体(中国专利CN100465278C,中国专利CN100383248C,中国专利CN101948862B)；(3)将含有特定限制酶位点的一对寡核苷酸片段引入出发载体中，此限制酶位点的特点是其经相应酶(EcoRV)切割后能产生平末端，且切点前后碱基分别是T和A，然后以线性化的出发载体为模板，采用单引物PCR扩增或不对称PCR扩增产生单链，两条单链退火后即形成T载体(中国专利CN101177689B)。虽然T-A克隆方法相对基于限制性内切酶酶切连接的克隆构建方法，具有操作简单、阳性克隆率高等优点，但也存在一些不足之处，具体如下所述：(1)比如为了确保PCR过程中不会产生碱基突变，需要使用高保真酶扩增目的基因，而高保真酶具有3′-5′的外切酶活性，不会在PCR产物3′末端添加额外的碱基，而需要通过回收PCR产物再使用Taq酶进行加A反应，因此会使实验操作变的繁琐；(2)目前市场上销售的T载体制备步骤都比较繁琐，质量不稳定，价格昂贵，非重组背景较高，不能重复利用，不适合实验室自己制备生产；(3)蓝白斑筛选法，难以区分假阴性菌落；(4)传统的T-A克隆方法，不能控制插入到载体中目的基因的方向；(5)采用第一类方法制备的T载体存在加尾效率低以及线性化质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题；(6)采用第二类方法制备的T载体存在前T载体可能酶切不完全和酶切后连接效率低的问题。并且部分内切酶价格昂贵，或者容易在普通的克隆载体上有多个识别位点，因而限制了其应用；(7)采用第三类方法制备的T载体虽然具有极低的非重组背景，但是采用PCR扩增的方法一方面会增加操作步骤，另一方面必须使用价格昂贵的高保真酶扩增载体，增加生产成本。因此，构建一种制备方法简单与稳定，同时具有快速、阳性克隆率高、高通量、价廉和可以循环使用的技术优势的定向克隆载体，将为分子生物学提供一种强有力的基因分析工具和具有广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术的目的：一、针对现有技术存在的上述不足，基于最新的无缝克隆技术，提供一种制备简单、阳性克隆率大于90％、价廉、不依赖于连接酶和可以循环使用的定向克隆载体；二、为各种基因文库的构建提供一种高通量的快速克隆载体。
技术实现思路
之一：一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体的制备方法以温州医科大学酶工程与医学诊断研究所保藏的MEK5-pCMV5质粒为模板，采用引物MEK5-pUM19-T-F(序列如SEQIDN0.1所示)和MEK5-pUM19-T-R(序列如SEQIDN0.2所示)扩增，所得PCR产物经加A反应后与pUM19-T(序列如SEQIDN0.4所示)载体连接，构建MEK5-pUM19-T重组质粒。其中上述两条引物5′端为无缝克隆同源臂，同源臂序列与TaKaRa公司的pColdI和pColdTF载体的多克隆位点中KpnI酶切位点两侧序列一致，3′端为扩增MEK5基因编码框序列，中间为KpnI酶切位点(如图2所示)。采用KpnI单酶切MEK5-pUM19-T重组质粒，胶回收载体片段，然后采用T4连接酶将回收的载体片段进行自连即获得新的质粒，命名为pWMU19-T(如图1所示)。因此，只要任何PCR产物两端含有与pWMU19-T载体一致的同源臂序列，都可以通过无缝克隆技术快速克隆至经KpnI单酶切的pWMU19-T线性化载体中。
技术实现思路
之二：一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒本专利技术专利提供一种基于无缝克隆技术的大肠杆菌克隆载体试剂盒，除试剂盒包装、衬垫、试剂管和使用说明书以外，该试剂盒组成成分包括：(1)线性化的pWMU19-T系列克隆载体；(2)对照DNA片段(500bp)；(3)无缝克隆酶；(4)5×无缝克隆缓冲液；(5)菌落PCR通用鉴定引物；(6)无菌ddH2O。其中所述线性化pWMU19-T系列克隆载体浓度为0.02pmol/μl，所述对照DNA片段(500bp)浓度为0.04pmol/μl，所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液可分别购自以下公司：和元生物技术(上海)股份有限公司，ClonFast无缝克隆试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司，同源重组一步克隆试剂盒，货号C112-01/02；南京金斯瑞生物科技有限公司，CloneEZPCR克隆试剂盒，货号L00339；Clontech，SeamlessCloningwithIn-FusionCloningKits，货号638911/638918；Invitrogen，SeamlessCloningandAssemblyEnzymeMix，货号A14606。所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液也可以通过参考文献(ZhangY,WerlingU,EdelmannW.SeamlessLigationCloningExtract(SLiCE)cloningmethod.MethodsMolBiol.2014,1116:235-244)制备生产。所述菌落PCR通用鉴定引物(序列如SEQIDN0.6和7所示)和灭菌水都是本领域常规试剂。本专利技术所述试剂盒可于-20℃保存一年。本专利技术所述试剂盒的制备方法如常规。本专利技术所述一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒，具备以下创新点和技术优势：1.常用的表达载体构建流程为：使用5′端分别含有不同限制性内切酶识别位点的正反引物扩增目的基因，PCR产物加A反应后，采用T-A克隆技术连接至T载体，测序正确后再采用上述两个限制性内切酶酶切重组T载体，回收双酶切后目的基因片段，使用T4连接酶将其连接到同样经双酶切与回收后的表达载体中构建重组表达质粒。而使用本专利技术所述方法构建的前克隆载体的同源臂序列可以为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点上/下游15-20bp的同源序列_(如图1和图2所示)。因此，采用5′端含有同源臂的引物扩增的PCR产物，可以同时通过同源重组连接到克隆载体和表达载体中，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：通过设计一对如图2所示的从引物5′至3′端依次为15‑20bp同源臂序列、同一限制性内切酶识别位点和目的基因编码框扩增序列的引物扩增目的基因，其PCR产物经加A反应后，连接至pUM19‑T出发载体中构建重组克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切重组克隆载体，回收载体片段，使用T4连接酶使其自连后构建前克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切前克隆载体，回收后载体片段即为本专利技术所述克隆载体。

【技术特征摘要】
1.一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：通过设计一对如图2所示的从引物5′至3′端依次为15-20bp同源臂序列、同一限制性内切酶识别位点和目的基因编码框扩增序列的引物扩增目的基因，其PCR产物经加A反应后，连接至pUM19-T出发载体中构建重组克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切重组克隆载体，回收载体片段，使用T4连接酶使其自连后构建前克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切前克隆载体，回收后载体片段即为本发明所述克隆载体。2.根据权利要求1所述的一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：所述克隆载体的构建是以pUM19-T载体为出发载体，pUM19-T是在线性化pUC19载体的基础上，去除多克隆酶切位点。如果选定酶切前克隆载体的限制性内切酶在pUM19-T载体中存在识别位点，需先采用基因定点突变技术将该识别位点突变后，再构建前克隆载体。3.一种基于无缝克隆技术的克隆载体，其特征在于：所述克隆载体两端的同源臂可以为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点的上/下游15-20bp同源序列，因此，两端含有同源臂的PCR产物，可以同时通过同源重组置...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞一林，谭国强，吕建新，李江辉，李唐，张涛，孙倩倩，韩琴霞，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33