用于产生间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术通过包括在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群的步骤，在短时间内于不含异源组分的培养基中产生大量间充质干细胞。

Method for producing mesenchymal stem cells

The invention generates a large number of mesenchymal stem cells in a short time in a medium without heterologous components by including a step of culturing a cell population containing mesenchymal stem cells in the presence of fibronectin fragments.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生间充质干细胞的方法
本专利技术涉及间充质干细胞(MSC)的产生方法，特别是脂肪来源干细胞(ASC或ADSC)的产生方法。本专利技术还涉及通过该方法获得的间充质干细胞以及含有该细胞作为有效成分的再生医学用组合物。
技术介绍
间充质干细胞为源于中胚层组织(间充质)的体干细胞。由于间充质干细胞具有分化成属于间充质的细胞的能力，因此预期其可应用于再生医学，包括骨、血管、心肌等的重建。另外，间充质干细胞可作为胚胎学、分子生物学和药学领域的研究工具。已知MSC可得自各种组织，包括骨髓、脂肪组织、血液、胎盘、脐带和牙髓。由于MSC具有取决于获得MSC的组织的不同性质，因此取决于获得MSC的组织，MSC被称为骨髓来源干细胞、脂肪来源干细胞等。间充质干细胞常规得自骨髓。然而，在骨髓中只有少量间充质干细胞，并且间充质干细胞的数目随着年龄而减少。因此，从临床应用的观点来看，有必要收集数百毫升的骨髓以获得足够数目的间充质干细胞，这对患者是一个很大的负担。另一方面，间充质干细胞在皮下脂肪中丰富。由于皮下脂肪通过在局部麻醉下抽吸脂肪而易于获得，因此对患者的负担小。近年来，使用脂肪来源干细胞的临床研究正在增加。用于获得脂肪来源干细胞的一般方法包括使取自人的少量脂肪切片经受酶处理以获得细胞群，通过离心分离从细胞群沉积的基质血管组分(stromalvascularfraction,SVF)，和在含有牛血清的培养基中连续培养该组分以增殖(非专利文献1)。然而，从临床应用的观点来看，使用动物来源组分的牛血清具有很大问题。引用文献列表非专利文献非专利文献1：TissueEngineering,2001,第7卷,第2期,第211-218页。
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术解决间充质干细胞的常规产生方法存在的上述问题。本专利技术的一个目的为提供一种在短时间内产生大量间充质干细胞的方法。问题的解决方案本专利技术的专利技术人为实现该目的进行了深入研究，结果他们发现，通过在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群，在短时间内于无异源物培养基中产生了大量间充质干细胞。因此，本专利技术得以完成。本专利技术的概要包括：[1]一种产生间充质干细胞的方法，所述方法包括在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群的步骤，[2][1]的方法，其中纤连蛋白片段为具有选自细胞粘附结构域和肝素结合结构域的至少一个结构域的片段，[3][1]的方法，其中在存在纤连蛋白片段的情况下的培养步骤为培养与包被有纤连蛋白片段的固相接触的细胞群的步骤，[4][1]的方法，其中培养步骤为在无异源物培养基中培养细胞群的步骤，[5][4]的方法，其中无异源物培养基为无血清培养基或含有同种异体血清的培养基，[6][1]的方法，其中细胞群为源于人的细胞群，[7][6]的方法，其中细胞群为直接自身体组织分离的细胞群，[8][7]的方法，其中身体组织选自脂肪组织、骨髓、血液、胎盘、脐带和牙髓，[9][6]的方法，其中细胞群为从胚胎干细胞或诱导的多能干细胞分化或诱导的间充质干细胞，[10]一种通过[1]-[9]中任一项的方法获得的间充质干细胞，[11]一种含有[10]的细胞作为有效成分的治疗组合物，[12]一种产生属于间充质的细胞的方法，所述方法包括分化通过[1]-[9]中任一项的方法获得的间充质干细胞的步骤，和[13][12]的方法，其中分化步骤为在含有分化诱导物的培养基中的培养步骤，所述分化诱导物诱导间充质干细胞分化成另一种细胞。专利技术效果本专利技术使得能够在短时间内于无异源物培养基中产生大量间充质干细胞。附图说明[图1]图1显示在实施例1中开始培养之后第8天的显微图像。左图：条件A，中图：条件B，右图：条件C。[图2]图2显示实施例2中的培养天数和收集的细胞数目。[图3]图3显示实施例3中的间充质干细胞向各种细胞的分化。具体实施方式定义等：本文使用的术语“间充质干细胞(MSC)”意指源于中胚层组织(间充质)的体干细胞。已知间充质干细胞表达特定的细胞表面标志物，比如CD73、CD90和CD105。样品中作为起始原料或最终获得的细胞群存在的间充质干细胞可通过经免疫学方法(通过使用抗体检测它们)测试这些标志物的表达来检测或量化。本文使用的术语“脂肪来源干细胞(ADSC或ASC)”意指存在于脂肪组织的干细胞。脂肪来源干细胞包括在间充质干细胞中，并且保留与间充质干细胞相同的分化能力。本文使用的术语“同种异体的”意指生物体或生物体具有的基因等源于与标准物种相同的物种。术语“同种异体的”包括同基因的和自体的。本文使用的术语“异源的”意指生物体或生物体具有的基因等源于与标准物种不同的物种。本文使用的术语“无异源物的”意指不含源于与标准物种不同的物种的组分。在下文，本专利技术得到详细说明。(1)本专利技术间充质干细胞的产生方法<含有间充质干细胞的细胞群>本专利技术间充质干细胞的产生方法包括在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群的步骤。在下文，“含有间充质干细胞的细胞群”得到详细说明。“含有间充质干细胞的细胞群”不受特别限制，并且可为含有间充质干细胞的任何细胞群。用于本专利技术的细胞来源的生物体不受特别限制。用于本专利技术的细胞可源于任何生物体，优选地为哺乳动物。生物体的年龄和性别不受特别限制。在一个实施方案中，源于灵长类动物(例如黑猩猩、日本猕猴(Macacafuscata)、人)的细胞用于本专利技术。最优选地使用人细胞，但是本专利技术不限于使用人细胞。在间充质干细胞由本专利技术产生用于给予人的情况下，从与受体具有相同的组织相容性抗原类型或相似的组织相容性抗原的供体获得的细胞群优选地用作原料。更优选地，得自受体的细胞群用于产生间充质干细胞。“含有间充质干细胞的细胞群”可为直接自含有间充质干细胞的活组织分离的原代细胞、从胚胎干细胞或诱导的多能干细胞分化或诱导的间充质干细胞或者冷冻保存的上述细胞。本文使用的术语“直接”意指不实施离体培养/增殖步骤。含有间充质干细胞的活组织的实例包括骨髓、脂肪组织、血液、胎盘、脐带和牙髓。脂肪组织可通过抽吸脂肪或脂肪切除术(adipectomy)获得，这导致个体功能障碍的风险很小，并且因此适合作为上述细胞群的来源。脂肪组织由脂肪细胞组成，并且为一种活组织。用于本专利技术的脂肪组织来源的部位的实例包括(但不特别限于)皮下脂肪、内脏脂肪、肌内脂肪和肌间脂肪。其中，皮下脂肪为脂肪组织的优选来源，因为其可在局部麻醉下易于获得。制备脂肪组织的方法不受特别限制。脂肪组织可从整容手术中通过吸脂抽吸的组织碎片或在手术等中从活体切除的组织中含有的切除的脂肪组织制备。由于脂肪来源干细胞存在于大血管周围，因此其可从切除的脂肪组织获得比脂肪抽吸液更大的量。另一方面，从脂肪抽吸液制备干细胞会留下较小的手术疤痕，这给供体带来较小的负担。尽管通常使用一种脂肪组织，但是也可组合使用两种或更多种脂肪组织。可多次收集脂肪组织，并且可将收集的脂肪组织混合然后使用。脂肪组织的收集量可取决于供体的种类、供体组织的种类或间充质干细胞的必要量来确定。尽管本专利技术不应受到特别限制，但是间充质干细胞可得自0.3-20g脂肪组织。通过使用按比例放大或多次操作，可使用更大量的脂肪组织作为起始原料。如果需要，使收集的脂肪组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生间充质干细胞的方法，所述方法包括在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.03 JP 2015-2364421.一种产生间充质干细胞的方法，所述方法包括在存在纤连蛋白片段的情况下培养含有间充质干细胞的细胞群的步骤。2.权利要求1的方法，其中所述纤连蛋白片段为具有选自细胞粘附结构域和肝素结合结构域的至少一个结构域的片段。3.权利要求1的方法，其中在存在纤连蛋白片段的情况下的所述培养步骤为培养与包被有所述纤连蛋白片段的固相接触的所述细胞群的步骤。4.权利要求1的方法，其中所述培养步骤为在无异源物培养基中培养所述细胞群的步骤。5.权利要求4的方法，其中所述无异源物培养基为无血清培养基或含有同种异体血清的培养基。6.权利要求1的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：田原谦一，糠谷育卫，出野美津子，山口沙织，峰野纯一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP