一种促进甘遂中萜类化合物合成的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进萜类化合物合成的方法，采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理后进行萜类化合物的提取。最优提取时间为茉莉酸甲酯喷洒处理后36小时；本发明专利技术通过利用茉莉酸甲酯处理对甘遂萜类合成关键基因、以及次生代谢产物积累影响的研究，筛选出茉莉酸甲酯促进甘遂萜类合成的有效作用时间和浓度，为利用基因工程手段提升甘遂萜类的产量来解决甘遂药源短缺问题提供了理论依据。

A method for promoting the synthesis of terpenoids in Euphorbia Euphorbia

The invention discloses a method for promoting the synthesis of terpenoids, in which 0.5mg/L methyl jasmonate (MeJA) is sprayed on Gansui to extract terpenoids. The optimum extraction time is 36 hours after methyl jasmonate spraying treatment; the invention screens out the effective action time and concentration of methyl jasmonate to promote the synthesis of glycyrrhizin by the study of the influence of methyl jasmonate treatment on the key genes of glycyrrhizin synthesis and the accumulation of secondary metabolites, so as to extract glycyrrhizin by genetic engineering means. The production of Radix terpenis from Radix Euphorbia is the theoretical basis for solving the shortage of drug source of Euphorbia.

【技术实现步骤摘要】
一种促进甘遂中萜类化合物合成的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种萜类化合物的获得方法的方法。
技术介绍
甘遂EuphorbiakansuiLiou为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(EuphorbiaL.)多年生草本植物，是我国特有的传统中药材；主要分布于陕西、河南、山西、甘肃和宁夏等地，陕西是甘遂的道地产区。历代本草和《中国药典》中都收载[1-2]。其味苦，性寒，有毒，归肺、肾、大肠经，具有泄水逐饮、消肿散结等功效，主治各种水肿、腹水、血吸虫病、咳喘、肿瘤等症。甘遂的主要成分为二萜、三萜和甾体类化合物，现代研究表明,甘遂中的二萜类化合物和三萜类化合物都具有抗恶性肿瘤作用，甘遂根提取物在民间被广泛地用于治疗肿瘤[3]。此外，甘遂还具有抗肿瘤、抗癌、抗生育、抗病毒、调节免疫系统等活性[4-6]。萜类是植物中最大的次生代谢产物之一，参与植物的基本代谢、生长、发育和物质交换。众所周知植物体内萜主要通过位于胞质的甲羧戊酸途径(MVA)[7]和位于质体的脱氧木酮糖-5-磷酸途径(DXP)或甲基赤藓醇4-磷酸途径(MEP)[8]两条途径完成。IPP[9]是两条途径的共同中间体，IPP在异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的作用下部分转化为双键异构体DMAPP，这两种物质是所有萜类化合物的前体物质。高等植物体内IPP形成后，即与其异构体DMAPP各1分子在香叶基二磷酸合酶(GPPS)、法呢基二磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase，FPPS)，香叶基香叶基二磷酸合酶(geranylgeranyldiphosphatesynthase，GGPPS)催化下形成萜类合成途径在3种直接前体物质GPP、FPP和GGPP合成后，即进入最重要的萜烯生成阶段，萜烯合酶(terpenesynthase,TPS)在此阶段发挥着至关重要的作用。GPP在单萜烯合酶(monoterpenesynthase)作用下生成单萜烯(monoterpene，C10)，FPP在倍半萜烯合酶(sesquiterpenesynthase)作用下生成倍半萜(sesquiterpene，C15)，GGPP在二萜烯合酶(diterpenesynthase)作用下生成二萜烯(diterpene，C20)。茉莉酸甲酯(MeJA)是一种重要的细胞调节子，调节植物的生长、发育和次生代谢产物的合成等多种生理过程[10]。近年来，大量的研究表明，MeJA可以改善多种物种中次生活性成分的生成[11]茉莉酸信号分子参与植物生长发育众多生理过程的调控，研究报道MeJA可以调控与植物次生代谢相关的关键酶基因的表达，从而调控次生代谢产物的合成[12-13]，如茉莉酸甲酯处理影响灵芝中甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的表达水平[14]，阳春砂挥发性萜类代谢[15]；茉莉酸甲酯处理可诱导京大戟3个基因的表达，且愈伤组织中总三萜的含量明显提高，最高可较未处理样品增加27％[16]。通过比较茉莉酸甲酯(MeJA)处理前后基因表达谱的变化来揭示基因与代谢产物的关系，并找到参与活性产物合成的基因，从而进行代谢工程的研究[17-19]。但是，关于甘遂中如何促进其有效成分的含量尚未见报道。因此，本研究主要通过综合分析研究不同浓度MeJA在不同作用时间对甘遂中次生代谢产物萜类合成基因的表达以及总萜类和二萜类的含量的影响，筛选MeJA促进甘遂萜类合成的最佳浓度和最佳时间，从而为甘遂的生产实践、有效利用提供基础理论和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种外源性植物激素介导的甘遂中萜类化合物合成的方法，外源性茉莉酸甲酯从分子角度促进中药甘遂中萜类的合成，从而促进单位量甘遂药材的效价。本专利技术采用以下技术方案：一种促进甘遂中萜类化合物合成的方法，该方法为：采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理。一种萜类化合物的获得方法，采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理，36小时后进行萜类化合物的提取。进一步地，茉莉酸甲酯处理36小时对甘遂中萜类合成具有促进作用，使总萜含量(质量)达到未处理材料的2.8倍。进一步地，所述萜类化合物包括单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜等萜类化合物。进一步地，所述茉莉酸甲酯通过提高casbene和AACT的表达水平，促进萜类化合物的合成。本专利技术通过利用茉莉酸甲酯处理对甘遂萜类合成关键基因、以及次生代谢产物积累影响的研究，筛选出茉莉酸甲酯促进甘遂萜类合成的有效作用时间和浓度，为利用基因工程手段提升甘遂萜类的产量来解决甘遂药源短缺问题提供了理论依据。附图说明图1.不同浓度MeJA处理不同时间的样中casbene和AACT表达水平的变化。A.代表AACT基因表达的动态变化。B.代表casbene基因表达的动态变化。所有数值都用ACTIN基因的Ct值进行归一化。**代表技术标准差有显著性差异(P<0.05)。图2.qRT-PCR验证选择的萜类合成中编码主要酶的9个基因。蓝色柱形图显示转录组基因表达。红色折线图显示qRT-PCR验证的基因表达。柱形图上的误差线表明三个生物学重复之间的标准误(SE)。所有的数值均与ACTIN基因Ct进行归一化。**代表技术标准差有显著性(P<0.05)。图3.0.5mg/mLMeJA处理不同时间总萜和大戟二烯醇的含量变化。A代表总萜的含量变化。B代表大戟二烯醇的含量变化。CK,T1,T2andT3分别代表MeJA处理0h、24h、36h和48h。每一个柱形图上的误差线表明三个生物学重复的标准误(SE)。**代表技术标准差有显著性(P<0.05)。具体实施方式选择生长在西北大学植物园中的健康甘遂植物作为研究对象，分成四组，分别用200mM(5mg/L),20mM(0.5mg/L),2mM(0.05mg/L)MeJA均匀喷洒处理。一、MeJA浓度和处理时间筛选以MeJA不同浓度和处理时间为因素设计正交试验，对照组和不同浓度MeJA处理甘遂后12h、24h、36h和48h分别提取甘遂根、茎、叶中RNA。通过qPCR分析casbene和AACT两个基因表达量变化。筛选出MeJA影响萜类合成的最佳浓度和时间。表1：茉莉酸甲酯浓度和处理时间二、MeJA不同浓度和处理时间对萜类合成关键基因表达的影响1.RNA的提取和反转录选用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP441)，根据说明书要求，分别提取不同浓度MeJA处理不同时间段的甘遂叶中的总RNA。根据TaKaRaM-MLVReverseTranscriptaseandoligo(dT)18试剂盒，根据说明书进行反转录。表2：反转录反应体系试剂使用量终浓度5xPrimeScriptRTMasterMix4ul1xTotalRNA6ulRnaseFreedH2O10ul反转录反应条件：37℃，15min(反转录反应)，85℃，5ses(反转录酶的失活反应)，4℃取出反转录产物cDNA，备用。2.RealTimePCR根据TaKaRaPremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)(CodeNo.RR820A)说明书，选用25μL反应体系进行RealTimePCR反应的操作方法，β-ACTIN作为内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进甘遂中萜类化合物合成的方法，其特征在于，该方法为：采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理。

【技术特征摘要】
1.一种促进甘遂中萜类化合物合成的方法，其特征在于，该方法为：采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理。2.一种萜类化合物的获得方法，其特征在于，采用0.5mg/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对甘遂进行喷洒处理，36小时后进行萜类化合物的提取。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，茉莉酸甲酯处...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡霞，李鹏，张悦，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61