导致病毒抗性的拷贝数变体制造技术

本发明专利技术涉及包含两个紧密连锁的RDR1基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因反向定向，并且当存在于植物中时该遗传决定子导致病毒抗性。在一个实施方案中，组合中的RDR1基因之一由SEQ ID No.1表示或与其具有至少70％序列同一性，并且组合中的另一RDR1基因由SEQ ID No.3表示或与其具有序列至少70％序列同一性；或者组合中的RDR1基因之一编码由SEQ ID No.2表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质，并且另一RDR1基因编码由SEQ ID No.4表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质。

Copy number variants that cause viral resistance

The present invention relates to at least two copies of a genetic determinant comprising a combination of two tightly linked RDR1 genes, wherein the two tightly linked RDR1 genes are reversely directed and lead to viral resistance when present in plants. In one implementation, one of the RDR1 genes in a combination is represented by or has at least 70% sequence identity with SEQ ID No.1, and another RDR1 gene in a combination is represented by or has at least 70% sequence identity with SEQ ID No.3; or one of the RDR1 genes in a combination encodes a protein represented by SEQ ID No.2 A protein with at least 70% sequence identity, and another RDR1 gene encodes a protein represented by SEQ ID No.4 or a protein with at least 70% sequence identity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】导致病毒抗性的拷贝数变体本专利技术涉及导致植物的病毒抗性的遗传决定子。本专利技术还涉及产生这种植物的方法和选择这种植物的方法。本专利技术还涉及包含所述遗传决定子的病毒抗性植物或种子。病毒构成了感染植物，造成影响作物种植的方面诸如植物生长、植物活力、产品质量和产量潜力的负效应的主要病原体群。像大多数真核生物一样，植物已经建立了对抗侵入病原体诸如病毒的通用防御反应。然而，致病性病毒能够通过使用不同的抑制子机制来逃避这种防御反应。因此，在宿主植物物种中，特定的防御反应已进化来抵抗致病性病毒的抑制子机制。当植物或作物受到疾病的影响时，在许多情况下，这不仅仅受单一病毒影响，而是受两种或更多种病毒或其它病原体的组合影响，这只会扩大该问题。许多专业种植的作物对可影响它们的几种病原体具有抗性。育种计划的挑战之一是有效地组合与该特定作物最相关，或者例如与该作物的特定栽培季节或区域相关的抗性。在共同未决的申请PCT/EP2015/057409中描述了经修饰的RDR1基因，其赋予对病毒，特别是针对某些科的病毒，具体地针对马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)和/或帚状病毒科(Virgaviridae)的病毒的抗性。这种经修饰的RDR1基因在黄瓜(Cucumissativus)中的存在导致对黄瓜脉黄化病毒(CucumberVeinYellowingVirus，CVYV)的抗性，并且可可能促成对其它病毒诸如例如黄瓜绿斑驳花叶病毒(CucumberGreenMottleMosaicVirus，CGMMV)、黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus，CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZucchiniYellowMosaicVirus，ZYMV)的抗性。然而，导致本专利技术的黄瓜中的进一步研究表明，对CVYV和CGMMV的抗性往往一起存在，但也存在仅对CVYV有抗性或仅对CGMMV有抗性的重组体。因此单独修饰RDR1基因并不能确保获得针对CVYV和CGMMV两者以及潜在地其它病毒感染的抗性。另外，鉴定经修饰的RDR1基因的存在总是预测抗CVYV的抗性，但并不总是预测针对CGMMV的抗性。对于一些另外的病毒，以及在其中经修饰的RDR1基因促成病毒抗性的一些另外的作物中，预期会出现类似的情况。然后确定了在黄瓜的基因组中有两个紧密连锁的RDR1基因位于第5号染色体上。这两个RDR1基因不是精确的拷贝，但非常相似，在本文中被命名为CsRDR1_I或14137以及CsRDR1_II或14138。此外，所述两个紧密连锁的RDR1基因是反向定向的，更具体地说，它们通过其3'末端彼此连接。令人惊讶地发现，当两个紧密连锁的反向定向的RDR1基因的这种组合被重复(导致两个或更多个拷贝的该组合)、并因此具有总共四个或更多个RDR1基因时，这种重复导致植物的病毒抗性增加。该组合的两个或更多个拷贝的存在被称为拷贝数变体，所述拷贝数变体的存在影响病毒抗性。因此，本专利技术提供了遗传决定子，其包含两个紧密连锁RDR1基因的组合的至少两个拷贝，所述两个紧密连锁的RDR1基因反向定向，并且当存在于植物中时，该遗传决定子导致病毒抗性。两个紧密连锁的反向RDR1基因的组合在本文中被定义为“组合”或“RDR1基因座”。如本文中所用，与在组合中存在的两个RDR1基因相关联的“紧密连锁”意味着在这两个RDR1基因之间不发生重组。在一个实施方案中，组合中两个RDR1基因之间的距离不超过3000个核苷酸。基因之间的核苷酸不是所述基因的序列的一部分。在组合中存在的两个RDR1基因之间没有其它基因。术语“拷贝”和“重复”表示相同，并且在本文中可互换使用。如本文中所用，“重复”和“拷贝的”包括倍数增加至两个或更多个拷贝的组合。因此两个或更多个拷贝是两个RDR1基因的组合的不同拷贝数变体。本专利技术的遗传决定子可包含两个紧密连锁的、反向定向的RDR1基因的组合的两个拷贝。遗传决定子还可包含三个拷贝的组合，或四个拷贝或四个以上的拷贝。该组合的至少两个拷贝的存在导致植物的病毒抗性。植物可能由于存在本专利技术的遗传决定子而变得对某种病毒产生抗性，或者已具有抗性的植物的抗性可能增加。将抗性水平与仅具有单一版本的两个紧密连锁的、相反定向的RDR1基因组合的等基因植物相比较。遗传决定子中所述组合的每个额外拷贝的存在都可导致病毒抗性水平的进一步增加。这意味着例如具有四个拷贝的植物比具有三个拷贝的植物更具抗性，所述具有3个拷贝的植物又比具有两个拷贝的植物更具抗性。在本专利技术的遗传决定子中重复的RDR1基因座任选地包含与反向定向的RDR1基因之一相邻的一个另外的基因，该另外的基因也作为组合的一部分被重复以形成另一版本的本专利技术的遗传决定子。在本专利技术的遗传决定子中RDR1基因组合的两个或更多个拷贝或复制可以以串联重复的形式存在，这意味着各重复彼此直接相邻地位于染色体上。当各拷贝之间不存在核苷酸或存在最多10个核苷酸时，各重复是直接相邻的。每个重复任选地包含与RDR1基因之一相邻的一个另外的基因。重复也可以以散布的重复存在，这意味着在重复拷贝之间存在大约一千、二千，甚至六千个核苷酸。较大的染色体区段也可以存在于拷贝之间。任选地，重复之一甚至可以位于不同的染色体上。多个拷贝的所述组合这样在植物基因组内的存在足以形成本专利技术的遗传决定子。拷贝数变体(Copynumbervariants，CNV)近来被鉴定是遗传变异的主要潜在来源之一。然而，用于确定基因组中CNV的存在以能够鉴定其效应的方法与鉴定基因内的其它变异(诸如存在于基因内的修饰)非常不同。就后者而言，通常对序列的分析可以鉴定比较中的序列之间的差异。随后将这些差异用于开发与包含修饰的基因组区域连锁的标记或包含该突变本身的标记。然而，这对于确定CNV的存在是不可行的，因为这些CNV不基于基因的核苷酸序列的差异。拷贝数变体必须通过确定基因组内特定序列，特别是形成基因或基因部分的序列的重复来确定。拷贝数的这些变化可以彼此接近，例如在同一染色体上，但它们也可位于基因组中的不同位置。由CNV引起的大部分遗传变异，特别是它们对特定表型性状的影响和关系尚未被揭示。在一个优选实施方案中，本专利技术的遗传决定子包含所述两个紧密连锁的、反向定向的RDR1基因的组合的至少3个拷贝。在一个实施方案中，组合的RDR1基因中的至少一个的序列由SEQIDNo.1表示，其为CsRDR1_II的序列，或者(按照增加的优先顺序)与SEQIDNo.1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。所述相似序列应该作为CsRDR1_II基因的功能同源基因的基础。或者，组合中的RDR1基因中的至少一个具有编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或者编码具有按照增加的优先顺序与SEQIDNo.2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列的蛋白质的序列。在一个实施方案中，所述组合的RDR1基因中的至少一个的序列由SEQIDNo.3表示，其是CsRDR1_I的序列，或者(按照增加的优先顺序)与SEQIDNo.3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含两个紧密连锁的RDR1基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因反向定向，并且当存在于植物中时，该遗传决定子导致病毒抗性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 NL 20155471.一种包含两个紧密连锁的RDR1基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因反向定向，并且当存在于植物中时，该遗传决定子导致病毒抗性。2.权利要求1所述的遗传决定子，其包含所述两个紧密连锁的反向定向的RDR1基因的组合的三个、四个或更多个拷贝。3.权利要求1或2所述的遗传决定子，其中a)所述组合中的RDR1基因中的至少一个由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70％序列同一性；或b)所述组合中的RDR1基因中的至少一个编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或编码与SEQIDNo.2具有至少70％序列同一性的蛋白质。4.权利要求1或2所述的遗传决定子，其中a)所述组合中的RDR1基因中的至少一个由SEQIDNo.3表示或与其具有至少70％序列同一性；或b)所述组合中的RDR1基因中的至少一个编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质或编码与SEQIDNo.4具有至少70％序列同一性的蛋白质。5.权利要求3或4所述的遗传决定子，其中a)所述组合中的RDR1基因之一由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70％序列同一性，并且所述组合中的RDR1基因之一由SEQIDNo.3表示或与其具有序列至少70％序列同一性；或b)所述组合中的RDR1基因之一编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质，并且RDR1基因之一编码SEQIDNo.4表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质。6.权利要求1-5中任一项所述的遗传决定子，其中所述组合中的RDR1基因中的至少一个在起始密码子的上游具有插入缺失。7.权利要求1-6中任一项所述的遗传决定子，其中反向存在的两个RDR1基因之间的距离不超过3000bp。8.权利要求1-7中任一项所述的遗传决定子，其中两个RDR1基因的组合的拷贝之间的距离不超过6000bp，优选不超过1000bp，最优选0bp。9.权利要求1-8中任一项所述的遗传决定子，其中所述RDR1基因之一是CsRDR1_II，由SEQIDNo.1表示，或者与其具有至少90％序列同一性，并且所述RDR1基因之一是CsRDR1_I，由SEQIDNo.3表示，或者与其具有至少90％序列同一性，所述遗传决定子在黄瓜植物中的存在导致对黄瓜绿色斑驳花叶病毒的抗性。10.权利要求6-8中任一项所述的遗传决定子，其中所述RDR1基因之一是CsRDR1_I，由SEQIDNo.3表示，或者与其具有至少90％的序列同一性，并且所述RDR1基因之一是经修饰的CsRDR1_II，由SEQIDNo.5表示，或与其具有至少90％的序列同一性，所述遗传决定子在黄瓜植物中的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜脉黄化病毒的抗性。11.一种用于产生病毒抗性植物的方法，其包括将权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子引入植物。12.一种用于选择病毒抗性植物的方法，其包括测定反向存在的两个紧密连锁的RDR1基因的组合的拷贝数，并选择包含至少两个拷贝，优选至少三个拷贝的所述组合的植物作为病毒抗性植物，所述病毒抗性植物包含如权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子。13.权利要求11或12所述的方法，其中所述植物属于选自菜豆(Phaseolusvulgaris)、甜菜(Betavulgaris)、甘蓝(Brassicaoleracea)、胡萝卜(Daucuscarota)、莴苣(Lactucasativa)、甜瓜(Cucumismelo)、黄瓜(Cucumissativus)、西葫芦(Cucumispepo)、菠菜(Spinaciao...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·德约德，R·J·J·M·弗里特尔斯，
申请(专利权)人：瑞克斯旺种苗集团公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL