一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液制造技术

本发明专利技术提供了一种人脂肪干细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括低密度脂蛋白，海藻糖，甘油，卵磷脂，多肽，bFGF，维生素E，还原性谷胱甘肽。本发明专利技术提供的细胞冻存液用于冻存人脂肪干细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。具有较好的应用前景。

Cryopreservation of human adipose derived stem cells

The invention provides a cryopreservation solution for human adipose derived stem cells and a preparation method thereof. The cell cryopreservation solution includes low density lipoprotein, trehalose, glycerol, lecithin, polypeptide, bFGF, vitamin E, reduced glutathione. The cell cryopreservation solution provided by the invention is used for cryopreservation of human adipose stem cells, especially for improving the survival rate of cryopreserved cells after resuscitation. It has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液本专利技术是申请号为“201710643072.1”、专利技术名称为“一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液”专利技术专利的分案申请。
本专利技术涉及组织细胞培养
，具体涉及一种人脂肪干细胞冻存液及其制备方法和应用。
技术介绍
脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69％，S期占24％，G2/M期占8％。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖I倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15％。由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞的需求非常强烈。现在，将生产好的细胞进行冷冻保存，使用时再几种解冻使用也是常规的使用模式。然而现有技术中干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的神经干细胞，开展有效的神经干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存人脂肪干细胞的方法对于促进人脂肪干细胞的研宄和应用具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种人脂肪干细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。红果黄肉楠是一种小乔木，申请人经过研究发现，该植物中具有能够耐寒冷的物质存在，因此，申请人通过高通量筛选获得了相应的具有耐寒的多肽，因此，申请人尝试将其加入到冷冻保存液中，用于保存细胞。本专利技术的技术方案如下：一种人脂肪干细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有:0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培养基定容至100ml，所述多肽的序列如SEQIDNO：1-32任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为KATS-1、KATS-2、KATS-3、KATS-4、KATS-5、KATS-6、KATS-7、KATS-8、KATS-9、KATS-10、KATS-11、KATS-12、KATS-13、KATS-14、KATS-15、KATS-16、KATS-17、KATS-18、KATS-19、KATS-20、KATS-21、KATS-22、KATS-23、KATS-24、KATS-25、KATS-26、KATS-27、KATS-28、KATS-29、KATS-30、KATS-31、KATS-32，其依次对应于SEQIDNO：1-32。在本专利技术的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素E和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。本专利技术还提供了一种人脂肪干细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。本专利技术还提供了一种人脂肪干细胞冻存方法，包括以下步骤:A.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；B.细胞悬液制备:培养生长成单层的人脂肪细胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；C.冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；D.细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍DMEM液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细胞/ml-1010细胞/ml。本专利技术的有益效果:本专利技术的人脂肪干细胞冻存液，复苏细胞存活率可达97％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。本专利技术的干细胞冻存液可以长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。本专利技术神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。具体实施方式实施例1多肽的制备取红果黄肉楠叶片5g，清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量8000IU/g叶片，酶解温度47℃，pH值7.5，酶解时间1.5h，酶解完成后90℃灭酶10min；灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4％活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50(SephadexG-50)进行多肽分离，20mmol/LHCl溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到32个小肽的序列具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如SEQIDNO：1-32所示。分别命名为KATS-1～32。实施例2人脂肪干细胞冻存液的制备将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQIDNO：1所示。实施例3人脂肪干细胞冻存液的制备将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQIDNO：2所示。实施例4人脂肪干细胞冻存液的制备将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQIDNO：3所示。实施例5人脂肪干细胞冻存液的制备将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脂肪干细胞冻存液，其特征在于，其特征在于由如下各组分组成：0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v，最后用DMEM培养基定容至100ml。

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪干细胞冻存液，其特征在于，其特征在于由如下各组分组成：0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v，最后用DMEM培养基定容至100ml。2.权利要求1所述的人脂肪干...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，
申请(专利权)人：李倩，
类型：发明
国别省市：江苏,32