（3R,5S）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种(3R,5S)‑6‑ 氯 ‑3,5‑ 二羟基己酸叔丁酯的制备方法，本发明专利技术使用开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)作为全细胞生物催化剂，从(S)‑CHOH开始不对称合成，能够实现反应的一步合成，并在发酵液不浓缩的情况下获得较高的转化率。

【技术实现步骤摘要】
(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法
本专利技术属于制药工业生物
，具体涉及一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法。
技术介绍
具有光学活性的β，δ-二羟基酯已经在天然产品、多羟基化合物以及手性药物的合成中得到了广泛的运用。(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯是一种重要的药物中间体，可用于合成HMG-CoA还原酶的抑制剂(他汀类药物)，这类药物可以有效的防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。目前合成(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法主要有化学方法和生物方法。WolbergM等将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称加氢还原成(3R,5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯需要低温催化合成，对反应器的要求较高，而且催化剂的价格昂贵，成本较高，因此运用生物法进行催化合成具有良好的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，使用开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)作为全细胞生物催化剂，从(S)-CHOH开始进行不对称合成。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，包括如下步骤：(1)发酵培养L.kefirATCC35411全细胞菌株；(2)在发酵液中添加底物(S)-CHOH、葡萄糖和MgCl2，进行催化转化；(3)产物分离提取。本专利技术的方法，所述步骤(1)中，富集培养的培养基成分为酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L,一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L；发酵培养基成分为酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L，发酵pH6.0，温度30℃。所述步骤(2)中，在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。或将发酵液浓缩至OD660＝100，后在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用NaOH调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入氮气，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。所述步骤(3)中，取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min分离菌体细胞，取上清用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸，45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，获取所需产物。本专利技术的方法使用L.kefirATCC35411作为全细胞生物催化剂，从(S)-CHOH开始进行不对称合成，反应产物转化率高，且在发酵液不浓缩的情况下可获取较高的转化率。附图说明图1为本专利技术技术路线图；图2为不同pH对转化率影响的曲线图；图3为(3R,5S)-CDHH标准样品的液相色谱图；图4为本专利技术制备方法产物的液相色谱图。具体实施方式本专利技术开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)菌株购自ATCC菌种保藏中心，菌株型号为ATCC35411。实施例1发酵培养全细胞菌株(1)将冷冻的L.kefir细胞(-20℃)在室温下解冻，并用磷酸钾缓冲液(200mM，pH6.5)洗涤。以4500rpm离心10分钟，除去上清液。然后将细胞沉淀物悬浮于培养基(酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L)中富集培养，装液量：200ml/500mL，接种量：2％(v/v)，摇床150rpm，温度30℃，培养24h。(培养指标：OD660>1.5)。(2)在5L的发酵罐中进行发酵，装液量：1.8L/5L，接种量10％，接入发酵培养基(酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸镁0.05g/L，吐温801g/L，pH6.0)温度30℃，发酵pH6.0，通空气，通气速度0.6VVM，转速100-200rpm。当葡萄糖浓度＜5g/L时，开始补料，补料速率：5mL/L/h补料12h后，加大速率至9mL/L/h，同时进行葡萄糖浓度的实时监控，补料培养基(酵母粉160g/L，葡萄糖400g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，一水合硫酸镁0.125g/L)，培养72h。(培养指标：最后OD660≈20)。实施例2全细胞催化将发酵液分不浓缩和浓缩两种方式进行全细胞催化；(1)发酵液不浓缩，直接进行催化转化。按底物浓度20mM、40mM、60mM、100mM进行四组实验，反应体系为3L发酵罐，转化条件分别为:实验组1：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，20mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。实验组2：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，40mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。实验组3：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，60mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。实验组4：添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，100mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。(2)发酵液浓缩至OD660＝100，将发酵液在4100rpm离心15min，去上清后用200mM，pH6.5的磷酸钾缓冲液将菌泥重悬，进行催化转化。反应体系为0.6L发酵罐，转化条件如下：实验组5：10mM氯化镁，400Mm葡萄糖，100mM(S)-CHOH底物，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5，27℃，转化过程中通N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压，反应12h后，每间隔5h液相检测转化率及e.e值。实施例3本实施例基于摇瓶培养，说明不同的pH对转化效率的影响100mL摇瓶培养，添加2mM氯化镁，80mM葡萄糖，20mM(S)-CHOH底物，分别配制pH为5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸盐缓冲液，27℃进行磁力搅拌转化。反应结果如图2所示，pH6.0～7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)发酵培养L.kefir全细胞菌株；(2)在发酵液中添加底物(S)‑CHOH、葡萄糖和MgCl2，进行催化转化；(3)产物分离提取。

【技术特征摘要】
1.一种(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)发酵培养L.kefir全细胞菌株；(2)在发酵液中添加底物(S)-CHOH、葡萄糖和MgCl2，进行催化转化；(3)产物分离提取。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菌株选用L.kefirATCC35411。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，富集培养的培养基成分为酵母粉25g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，发酵培养基成分为酵母粉8g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，吐温801g/L，发酵pH6.0，温度30℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将发酵液浓缩至OD660＝100，后在发酵液中添加氯化镁，葡萄糖，(S)-CHOH底物进行催化转化；转化过程用氢氧化钠调节pH至6.0～7.0，27℃，转化过程中通入N2，通气速度为0.1～0.2VVM以维持微正压。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，转化过程用氢氧化钠调节pH至6.5。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，取出转化液，加入1:1乙酸乙酯，混匀，8000rpm离心10min分离菌体细胞，取上清用乙酸乙酯：水＝1:1萃取三次，取出产物(3R,5S)-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯后，去除水层，产物留在乙酸乙酯层，加入30g/L无水硫酸钠干燥1-2h，干燥后将溶剂进行旋蒸，45℃，压力从大气压降至150mPa，直至将溶剂旋干，旋蒸后将产物放入真空干燥箱进一步干燥，获取所需产物。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将-20℃冷冻的L.kefir细胞在室温...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，杨桥，戴仲雪，张尚杰，信丰学，章文明，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32