本发明专利技术公开了瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。实验结果表明：(1)瑞香素通过上调糖脂代谢关键因子AMPK的磷酸化水平，抑制脂合成关键基因SREBP‑1C、PNPLA3的表达，同时诱导脂氧化关键基因PPARα的表达，进而降低了肝细胞的脂堆积。(2)瑞香素通过上调PI3K的表达及pAKT/AKT水平，缓解胰岛素抵抗，从而促进肝细胞对葡萄糖的摄取。(3)瑞香素通过抑制活性氧生成关键基因CYP4A的表达，缓解肝细胞的氧化损伤。
Use of Daphne in preparing medicine for treating nonalcoholic fatty liver disease
The invention discloses the use of Daphne in preparing medicine for treating nonalcoholic fatty liver. The results showed that: (1) Daphnetin could inhibit the expression of SREBP_1C and PNPLA3, and induce the expression of PPARa, which is the key gene of lipid oxidation, by up-regulating the phosphorylation level of AMPK, which is the key factor of glucose and lipid metabolism. (2) Daphnetin can alleviate insulin resistance by up-regulating PI3K expression and pAKT / AKT level, thereby promoting glucose uptake by hepatocytes. (3) Daphnetin alleviates oxidative damage of hepatocytes by inhibiting the expression of CYP4A, the key gene for ROS production.
【技术实现步骤摘要】
瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途
本专利技术属于制药领域，涉及瑞香素的新用途，尤其是瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的新用途。
技术介绍
瑞香素(Daphnetin，DAP)化学名为7，8-二羟基香豆素(7，8-dithydroxycoumarin)，从瑞香属植物长白瑞香中分离出来的有效成分，是一种天然的香豆素衍生物。文献显示瑞香素具有良好的抗氧化、抗炎、抗凝血、抗病毒等药理活性，临床上主要用于血栓闭塞性脉管炎及其它闭塞性血管疾病和冠心病的辅助治疗。有文献报道瑞香素可以有效保护叔丁基过氧化氢诱导产生的细胞毒性、细胞凋亡和线粒体功能障碍，主要是通过减少活性氧(ROS)生成、减少丙二醛的形成。YuW等人研究发现由脂多糖或β-淀粉样蛋白诱导产生促炎介质包括白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α，瑞香素可抑制促炎因子的产生，瑞香素通过调节一系列细胞内信号通路，包括IKK/IκB，MAPKs和PI3K/AKT来抑制小胶质细胞活化和促炎反应。但瑞香素对于非酒精性脂肪肝的研究目前还没有报道。非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指由非酒精和其它不明确的损肝因素所导致的综合征，主要临床特征是肝细胞呈弥散性,伴随有大泡状脂肪病变，包含单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)和肝硬化三个阶段。NAFLD通常与肥胖和高血糖症有关,并伴有高甘油三酯(TG)、高血压和高胆固醇。非酒精性脂肪肝炎(NASH)是NAFLD中一种较为严重的病情，表征与酒精性肝炎相似，其病理表现主要为：大泡状脂肪病变，肝小叶中充斥着混合性炎症细胞，导致肝细胞膨胀和坏死，形成马洛里小体，最后不可逆的成为肝纤维化或肝硬化。由于NAFLD的发病机制比较复杂，病因并不明确，目前没有确切的特效药，控制饮食、纠正不良生活作息、加强体育锻炼控制体重是控制NAFLD最好的方法。药物治疗主要从发病机制的“两次打击”来着手，首要的是缓解肝细胞的脂肪堆积现象，研究表明熊去氧胆酸能减少肝脏脂质含量。现有的保肝药物并不能减少肝脏内脂肪堆积，但是可以通过拮抗脂质过氧化和氧化应激以及抗炎活性抗纤维化活性等，缓解NAFLD的“二次打击”，减轻NASH症状，防止病情的进一步恶化。保肝药物的治疗只能起到辅疗作用，并且主要是针对NASH病理类型。还可以使用一些抗氧化剂维生素E、还原型谷胱甘肽缓解第二次打击中产生的氧化损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的新用途。上述目的是通过以下技术方案实现的：申请人以HepG2细胞经0.5mM油酸处理作为体外研究细胞模型，HepG2细胞先用油酸处理24h，再用瑞香素(5、20、50μM)处理模型细胞24h。给药后用试剂盒检测细胞内TG含量和ROS含量及细胞对葡萄糖的摄取能力，用RT-qPCR法和WesternBlot法检测细胞中糖脂代谢关键基因(环腺苷酸依赖的蛋白激酶AMPK，固醇调节元件结合蛋白SREBP-1C，马铃薯糖蛋白样磷酯酶结构域蛋白PNPLA3，正过氧化物酶体增殖物激活受体PPARα，磷脂酰肌醇激酶PI3K，蛋白激酶AKT)和氧化应激相关基因(细胞色素P450CYP4A)的mRNA与蛋白表达量。实验结果表明：(1)与对照组相比，油酸处理组胞内TG含量，SREBP-1C和PNPLA3mRNA及蛋白的表达量明显上调，PPARαmRNA及蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显下调；与油酸处理组相比，油酸和瑞香素联合处理组胞内TG含量，SREBP-1C、PNPLA3mRNA与蛋白表达量明显下调，PPARαmRNA与蛋白表达量、AMPK磷酸化水平明显上调。(2)与对照组比较，油酸处理组细胞对荧光葡萄糖的吸收明显降低，PI3K蛋白表达及pAKT/AKT下调；油酸和瑞香素联合处理后，细胞的糖摄取能力提高，PI3K蛋白表达及pAKT/AKT上调。(3)与对照组比较，油酸处理组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显增多；与油酸处理组比较，油酸和瑞香素联合处理组胞内ROS含量及CYP4A表达量明显下调。实验结论：瑞香素能明显降低油酸诱导的肝细胞脂堆积，缓解胰岛素抵抗与氧化应激损伤，因此对非酒精性脂肪肝病具有一定的预防和治疗作用，其作用机制包括：(1)通过上调糖脂代谢关键因子AMPK的磷酸化水平，抑制脂合成关键基因SREBP-1C、PNPLA3的表达，同时诱导脂氧化关键基因PPARα的表达，进而降低了肝细胞的脂堆积。(2)通过上调PI3K的表达及pAKT/AKT水平，缓解胰岛素抵抗，从而促进肝细胞对葡萄糖的摄取。(3)通过抑制活性氧生成关键基因CYP4A的表达，缓解肝细胞的氧化损伤。附图说明图1：瑞香素对NASH模型细胞存活率的影响。图2：瑞香素对NASH模型细胞脂堆积的影响。图3：瑞香素对NASH模型细胞脂代谢相关基因mRNA的影响。图4：瑞香素对NASH模型细胞脂代谢相关基因蛋白的影响。图5：瑞香素对NASH模型细胞糖摄取的影响。图6：瑞香素对NASH模型细胞胰岛素信号传导相关基因蛋白的影响。图7：瑞香素对NASH模型细胞氧化损伤的影响。图8：瑞香素对NASH模型细胞氧化应激相关基因蛋白的影响。图9：瑞香素对NASH模型细胞AMPK磷酸化水平的影响。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行详细地说明。1.实验方法1.1细胞诱导给药1)细胞诱导将HepG2细胞消化制成均匀的细胞悬液,根据培养时间按比例稀释接种到6孔板中，待细胞贴壁后，于5％CO2、37℃恒温培养箱中放置培养24h。吸弃原DMEM完全培养基，缓慢加入PBS缓冲液清洗三次，加入含0.2％油酸钠、10％BSA的DMEM完全培养基，在培养箱中培养24h。在显微镜下观察细胞形态，若细胞表面出现黑色颗粒即诱导成功。2)给药处理先诱导贴壁细胞24h，在给药处理24h。设置空白组、溶剂组、模型组和给药组。1.2细胞存活率检测(MTT法)当培养瓶内细胞密度达到85％左右的时候进行传代，将细胞悬液稀释成5x103细胞/孔的密度接于96孔板，待细胞贴壁后，用DMEM完全培养基稀释好5、20、50、100μM的瑞香素，每孔给200μL，每组设置5个平行，于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h。细胞培养到相应时间点后，吸弃培养基，每孔小心加入20μLMTT与180μLPBS的混合液，在5％CO2、37℃细胞培养箱中孵育4h，缓慢吸弃MTT溶液，然后每孔加入150μL的DMSO溶液(DMSO可以溶解板子底部的蓝紫色甲鐟物质)。在酶标仪上中度震荡360s，然后测定其在570nm处的吸光值。1.3胞内甘油三酯含量的检测(TG法)1)经处理好的细胞，先用PBS缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留PBS缓冲液；2)加入100μL细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF、cocktail的混合溶液，将细胞轻轻覆盖，放置于37℃培养箱中反应10min，再用摇匀器摇匀；3)分组标记两套1.5mLEP管，将反应好的细胞收集在EP管中(反应好的细胞会形成一层膜，需将膜也收集起来)；4)将细胞原液稀释至适宜浓度，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，剩下的细胞原液于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。
【技术特征摘要】
1.瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩凤梅，廖璐，刘亚云，陈勇，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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