香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法技术

本发明专利技术公开了香蕉枯萎菌编码内源milRNAs及低丰度表达milRNAs的体外验证方法。本发明专利技术通过Deep sequencing深度测序获得的香蕉枯萎菌编码的小RNA及其表达谱，为后续进一步开发、利用小RNA在香蕉枯萎菌中的作用机制提供前期工作铺垫。本发明专利技术还提供了一种低丰度milRNAs的体外验证方法，利用本生烟作为替代植物，可以对milRNAs的靶标及其功能进行有效的分析，可以对深度测序的数据进行高通量的分析和验证，克服了目前小RNA研究中的不足，具有广泛的应用前景。

In vitro validation of Banana Fusarium wilt milRNAs and low abundance milRNAs

The invention discloses an in vitro verification method for banana Fusarium oxysporum encoding endogenous milRNAs and low abundance milRNAs expression. The microRNA encoded by Banana Fusarium oxysporum and its expression profile obtained by Deep sequencing can provide the preliminary work for further development and utilization of the mechanism of microRNA in Banana Fusarium oxysporum. The invention also provides a method for in vitro verification of milRNAs with low abundance. Using native tobacco as an alternative plant, the target and function of milRNAs can be effectively analyzed, and the data of deep sequencing can be analyzed and validated with high throughput. The method overcomes the shortcomings of current research on small RNA and has a wide application prospect. .

【技术实现步骤摘要】
香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法。
技术介绍
1、植物内源miRNA在转录后以基因沉默的方式负调控靶标基因的表达，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用真核生物的小RNA主要分为microRNAs(miRNAs)、siRNAs和piRNAs。miRNA和siRNA长度约为20～25nt，均由类似RNaseIII的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生，它们的形成既有联系又有区别。siRNA途径是由是外源入侵，如病毒，转座子以及转基因等产生变体dsRNA引发的；而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCLs(或Dicer类似蛋白)剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体(RNA-InducedSilencingComplex,RISC)，以PTGS的方式作用序列同源的mRNA，通过mRNA剪切、翻译抑制或者甲基化等方式调控基因的表达。piRNA依赖PiWi蛋白加工成熟，仅存在动物细胞。植物内源miRNA是由Ⅲ型RNase核酸酶Dicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过转录后水平以mRNA剪切或翻译抑制的方式沉默序列同源的mRNA靶标基因。miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。已经有大量的报道证实植物内源miRNAs参与植物对病原菌的PTI和ETI免疫，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用。2、真菌中存在与植物miRNA在结构、长度、作用方式上类似的小RNAs(microRNA-likeRNAs，milRNAs)。milRNAs最早在粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)中发现的，与植物microRNA在结构、小RNA长度以及作用方式上非常相似，因为与植物的miRNA类似而命名microRNA-likes(milRNAs)。粗糙脉孢霉的milRNAs通过Dicers，QDE-2，核酸外切酶活性的QIP效应蛋白以及具有III型RNase功能域的线粒体核糖体大亚基MRPL3蛋白(mitochondrialribosomalproteinlargesubunit,MRPL3)的不同组合，产生有四种不同的生物形成途径。虽然四种途径中从基因间隔区转录的RNA前体序列长度各异，但都具有发卡结构，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能够特异与Argonaute(AGO)蛋白结合；此外，实验证明milR-1可以通过基因沉默的方式作用调靶标序列(NCU07311)mRNA，主要通过抑制mRNA翻译的方式进行，与植物microRNA通过mRNA剪切和抑制转录的方式不一致(Leeetal.,2010)。milR-1是构巢曲霉中丰度最高的miRNA-likeRNAs，Xueetal.(2012)以milR-1为研究对象构建了依赖AGO的milR-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milR-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，与植物microRNA的生物合成途径不一样的是，除了QDE-2，Dicer等核心蛋白组分外，还需要QIP以及RNA外来复合体(exosome)的共同参与，加工成为成熟的小RNA(Xueetal.,2012)。随后，植物病原真菌的小RNA相关研究进展迅速，在稻瘟病(Magnaportheoryzae)(Nunesetal.,2011)油菜核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)(Zhouetal.,2012)葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)(Weibergetal.,2013；Wangetal.,2017a)疫霉(Phytophthora)(Fahlgrenetal.,2013)尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)(Chenetal.,2014)黄曲霉(Aspergillusflavus)(Baietal.,2015)小麦条锈(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)(Muethetal.,2015；Wangetal.,2017b)中陆续都发现存在milRNAs。随着技术的进步，深度测序可以预测到低丰度milRNA及其骨架序列的存在，但是由于病原真菌中大部分的milRNAs表达本底水平太低，常规的同位素32p-ATP标记的miRNA探针无法检测到低丰度的milRNAs，因此，无法对低丰度的milRNAs及其发夹序列进行验证。3、植物病原真菌与寄主之间存在跨界小RNA基因沉默，抑制寄主的免疫反应促进病原菌的侵染。病原真菌利用小RNA作为效应因子(effector)进入植物细胞内部抑制植物免疫防卫反应。灰霉菌引发的灰霉病可以侵染200多种植物。Weibergetal.(2013)的研究显示灰霉菌能够输送Bc-sRNAs进入寄主细胞通过与AGO1特异性结合抑制AGO1功能，沉默寄主的免疫相关基因促进病原菌侵染。拟南芥的Δago1缺失突变体由于丧失了AGO1功能，减少了对灰霉菌的敏感性；相反，灰霉菌的Δdcl1dcl2双突变体由于无法加工产生Bc-sRNAs而完全丧失了侵染性。因此，真菌病原物通过转移具有致病力的小RNA效应因子进入寄主细胞通过抑制寄主的防卫反应促进病原菌的侵染，该发现阐释了这种自然发生的跨界RNAi沉默现象作为病原真菌的一种更加高级的致病机制(Weibergetal.,2013)。此外，在葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)中还发现一个低丰度表达的Bc-siR37，仅侵染时上调表达，而Bc-siR37的3个确定的作用靶标都是寄主免疫相关的(Wangetal.,2017)。Bc-DCL1和DCL2是产生Bc-sRNAs的主要组分，沉默DCLs可以显著减少病原菌的致病力。病原菌存在环境RNAi可以吸收外部的RNA，在水果、蔬菜以及鲜花的表面施用靶向DCLs的dsRNA和sRNA可以通过调控Bc-sRNAs表达从而明显减轻灰霉病的症状(Wangetal.,2016；Wangetal.,2017a)。小RNA是病原真菌一类重要的致病因子。小麦条锈病编码的Pst-milR1仅仅在侵染时诱导表达，在Pst中通过BSMV基因沉默抑制Pst-milR1的表达明显减弱了条锈病的致病性，同时，在小麦中敲除其靶标小麦病程相关基因PR2(SM638)则增强了小麦对无毒菌株的感病性，正反实验证实Pst-milR1以跨界基因沉默方式靶向寄主免疫相关基因PR2(SM638)从而抑制寄主的免疫反应促进病原菌侵染(Wangetal.,2017b)。4、香蕉枯萎菌的研究香蕉枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活，属于典型的潜伏型侵染。早期外部症状表现不明显，中后期才表现症状，因此，给香蕉产业和香蕉种植者造成巨大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.香蕉枯萎菌milRNAs，其特征在于，所述香蕉枯萎菌milRNAs的基因序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:309任一所示。

【技术特征摘要】
1.香蕉枯萎菌milRNAs，其特征在于，所述香蕉枯萎菌milRNAs的基因序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:309任一所示。2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的milRNA至少一种。3.一种感受态细胞，其特征在于，所述感受态细胞含有如权利要求1所述的milRNA至少一种或含有权利要求2所述的载体。4.低丰度milRNAs的体外验证方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：在真菌的基因组DNA中设计引物扩增含有候选milRNA骨架的DNA序列，将所述DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，曾凡云，刘远征，孟春亮，张欣，漆艳香，谢艺贤，丁兆建，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46