本发明专利技术具体涉及一种人PD‑1蛋白胞外段亲和环肽C8及其应用。该亲和环肽C8的氨基酸序列为Cys‑Lys‑Trp‑Tyr‑Arg‑Pro‑Ser‑Glu‑Cys，即C‑K‑W‑Y‑R‑P‑S‑E‑C，其中两个半胱氨酸C之间形成一个二硫键，将肽首尾链接成为环状，该环肽分子量为1169.35。该亲和环肽C8能够亲和PD‑1从而阻断PD‑1/PD‑L1之间的相互作用，进而起到抗肿瘤效果。本申请以rhPD‑1‑Fc为靶分子，筛选获得人PD‑1蛋白胞外段的亲和环肽C8。亲和环肽C8作用目标明确，对表达PD‑L1蛋白的肿瘤抑制效果明显，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。
Human PD-1 protein extracellular domain affinity cyclic peptide C8 and its application
The invention specifically relates to a human PD 1 protein extracellular segment affinity cyclic peptide C8 and its application. The amino acid sequence of the affinity cyclic peptide C8 is Cys_Lys_Trp_Tyr_Arg_Pro_Ser_Glu_Cys, i.e. C_K_W_Y_R_P_S_E_C, in which a disulfide bond is formed between the two cysteine C chains, which link the peptide head and tail to form a ring with a molecular weight of 19.35. The affinity cyclic peptide C8 can bind to PD_1 and block the interaction between PD_1 and PD_L1, thus playing an anti-tumor effect. The aim of this study is to screen the affinity loop peptide C8 from the extracellular domain of human PD (1) protein by targeting rhPD 1 Fc. Affinity Cyclic Peptide C8 has a clear target of action and obvious inhibition effect on the expression of PD_L1 protein. Therefore, it has a good medical application prospect and provides a new choice for tumor immunotherapy.
【技术实现步骤摘要】
一种人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8及其应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8及其应用。
技术介绍
肿瘤，尤其是恶性肿瘤是影响全球发病率和死亡率的主要原因之一，肿瘤的治疗方法有传统的手术切除、放射性治疗、化学药物治疗等，也有新兴的肿瘤免疫疗法。肿瘤免疫疗法是通过激发机体自身的免疫、改善自身免疫能力对肿瘤细胞进行杀伤，并且能够建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移，从而达到抗肿瘤效果。随着研究的深入，肿瘤免疫疗法获得越来越获多的关注，并于2013年被《科学》杂志评为十大科学突破之首。在肿瘤免疫治疗中，CD8+T细胞是主要杀伤肿瘤的效应细胞，其激活过程需要通过MHC-I类分子介导的细胞免疫应答，激活过程中有两个信号，第一是识别信号，即肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞（DC）等抗原递呈细胞（APC）加工处理以后以MHC/表位复合物的形式递呈至APC表面，该复合物被T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，进而激活T细胞识别抗原的第一信号；与此同时，APC表达的共刺激分子和T细胞表面的对应受体或配体相互作用，产生T细胞活化的第二信号。根据第二信号产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子，其中负性共刺激分子在肿瘤免疫治疗过程中能够引起CD8+T细胞等效应细胞耗竭或者失活，从而引起肿瘤的免疫耐受和逃逸，负性共刺激分子中研究较为深入的是细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）。PD-1最早是在发生程序性死亡的细胞株中通过消减杂交的方法发现的，由288个氨基酸组成，相对分子质量是55,000Da，是I型跨膜糖蛋白，其胞外区包含一个IgV样结构域，有4个重要的N连接糖基化位点，并被重度糖基化。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞和髓系细胞表面。其公认的配体有PD-L1和PD-L2，由于PD-L2配体可能不仅仅是PD-1，因此，在抗肿瘤研究中主要把PD-L1作为PD-1的配体。PD-1/PD-L1信号在肿瘤的发生过程中，可以产生抑制T淋巴细胞活性，发生免疫耐受、促进肿瘤免疫逃逸的作用。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，可以有效激活机体T淋巴细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞。现有的研究已经表明PD-1/PD-L1信号通路是CD8+T细胞活化过程中非常重要的负性调控通路，可以引起肿瘤免疫耐受和逃逸，因此，研究通过阻断PD-1/PD-L1负性共刺激分子所介导的信号通路，打破肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8，并经过实验证明了该亲和环肽C8具有抗肿瘤活性。本专利技术采取的详细技术方案如下：一种人PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8，该亲和环肽包含9个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：Cys-Lys-Trp-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Cys，即：C-K-W-Y-R-P-S-E-C，其中氨基酸序列中首尾两端的两个半胱氨酸C之间形成一个二硫键（S-S），将肽首尾链接成为环状，该环肽分子量为1169.35，亲和环肽C8结构式如下图所示。所述人PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8在抗肿瘤免疫治疗或者制备抗肿瘤相关药物中的应用。所述应用中，肿瘤包括表达PD-L1蛋白的肿瘤。进一步地，所述表达PD-L1蛋白的肿瘤包括结肠癌、黑色素瘤。所述应用中，抗肿瘤相关药物包括亲和环肽C8、以亲和环肽C8为基础的改造肽及其类似物。本专利技术有益效果：本专利技术以rhPD-1-Fc为靶分子，通过液相筛选法进行噬菌体展示环七肽库高通量技术筛选时获得了人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8。针对该环肽进一步的体外亲和力实验、阻断PD-1/PD-L1蛋白结合实验和小鼠荷瘤实验表明，亲和环肽C8作用目标明确，对表达PD-L1蛋白的肿瘤抑制效果明显，且无明显毒副作用，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。附图说明图1为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8的ESI-MS质谱分析鉴定结果图；图2为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8与人PD-1蛋白的亲和力实验结果图；图3为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8阻断PD-1/PD-L1蛋白结合的实验结果图；图4为表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞结果图；图5为接种CT26的BABL/c小鼠肿瘤中表达PD-1+CD8+T细胞的实验结果图；图6为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种CT26的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；图7为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种CT26的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；图8为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种CT26的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响图；图9为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种B16的C57BL/6J小鼠体重变化的影响结果图；图10为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种B16的C57BL/6J小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；图11为人PD-1蛋白胞外段亲和环肽C8对接种B16的C57BL/6J小鼠的移植瘤瘤重的影响图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应该为限制本专利技术的范围。主要试剂：牛血清白蛋白（BSA），索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清（FBS），以色列BI公司；DMSO为普通市售产品；常用培养基和溶液：主要有LB培养基、上层琼脂、LB/IPTG/X-gal平板、ProteinA/GMixMagneticBeads、TBS缓冲液（50mMTris-HCl（pH7.5），含有150mMNaCl）、Tris-HCl（pH9.1）中和液、PEG-8000/NaCl沉淀液、Tris-T缓冲液、洗脱液（0.2MGlycine-HCl[pH2.2]，1mg/mLBSA）、中和液（1MTris-HCl[pH9.1]）、蛋白标记试剂盒MonolithNT™ProteinLabelingKitRED-NHS、PBS7.2、BSA、Tween-20、TBST洗涤液缓冲液均按照现有技术制备即可，不再详细描述；主要仪器：MST仪器，德国NanoTemper技术有限公司；流式检测仪，美国BD公司；生物材料：ER2738菌，美国NewEnglandBiolabs,Inc.公司；Anti-humanIgG1-FcPE抗体，eBioscience公司；hIgG1-Fc蛋白，Acrobiosystems公司；CT26细胞、MC38细胞、B16细胞、B16-F10细胞、4T-1细胞、Lewis细胞、CHO-K1-hPD-L1细胞，来源于ATCC细胞库；接种结肠癌CT26的BABL/c小鼠，接种黑色素瘤B16的C57BL/6J小鼠，小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。实施例1为便于本领域技术人员具体实施本专利技术，专利技术人对PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8的筛选过程简要说明如下：利用噬菌体展示环七肽库筛选人PD-1的亲和环肽。简要步骤如下：（1）采用液相筛选法进行噬菌体展示环七肽库的筛选工作；（2）经过5轮的筛选后，与靶蛋白人PD-1胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；（3）然后从第5轮中挑选阳性克隆进行测序，共得本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人PD‑1蛋白胞外段的亲和环肽C8，其特征在于，该亲和环肽C8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Cys‑Lys‑Trp‑Tyr‑Arg‑Pro‑Ser‑Glu‑Cys，即：C‑K‑W‑Y‑R‑P‑S‑E‑C，其中两个半胱氨酸C之间形成一个二硫键（S‑S），将肽首尾链接成为环状，该环肽分子量为1169.35，亲和环肽C8结构式如下图所示。
【技术特征摘要】
1.一种人PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8，其特征在于，该亲和环肽C8的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：Cys-Lys-Trp-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Cys，即：C-K-W-Y-R-P-S-E-C，其中两个半胱氨酸C之间形成一个二硫键（S-S），将肽首尾链接成为环状，该环肽分子量为1169.35，亲和环肽C8结构式如下图所示。。2.如权利要求1所述人PD-1蛋白胞外段的亲和环肽C8在抗肿瘤免疫治疗相关药物中的应用。3.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：高艳锋，翟文杰，吴亚红，周秀曼，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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