本发明专利技术公开了一种花鲈白细胞介素IL‑12p40基因的cDNA，它的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了该花鲈白细胞介素IL‑12p40基因的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术还进一步公开了包括该cDNA的表达载体。以及花鲈白细胞介素IL‑12p40基因的编码蛋白或重组蛋白在制备具有抗菌和增强鱼免疫力功效的在药物中的应用。
Interleukin IL-12p40 gene and its application in sea bass
The present invention discloses a cDNA of interleukin 12 P40 gene of perch, whose nucleic acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The coding protein of the IL_12p40 gene of the bass is also disclosed. Its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The present invention further discloses an expression vector including the cDNA. And the application of the coding protein or recombinant protein of IL_12p40 gene in the preparation of antimicrobial and fish immunity enhancing drugs.
【技术实现步骤摘要】
花鲈白细胞介素IL-12p40基因及其用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及花鲈白细胞介素IL-12p40基因及其用途。
技术介绍
花鲈只能依靠先天免疫作为第一道防线来防止入侵病原微生物和环境毒性应激。细胞因子在促炎和免疫的几乎所有方面均具有重要作用。白细胞介素(interleukin,IL)是一类具有复杂免疫调节功能的细胞因子，它们参与调节细胞增殖、成熟、迁移和粘附，及免疫细胞的分化和激活。白细胞介素具有促炎和抗炎症的功能，一些成员可以作为助T细胞的化学趋化物，功能类似于趋化因子，其他的会参与到抗病毒的细胞应答过程，具有类似于干扰素的功能。白细胞介素12是一类主要由炎性细胞产生的细胞因子，具有广泛的生物学活性。同时IL-12是唯一一类异源二聚体的细胞因子。它由亚基α-chain(p35)和β-chain(IL-12p40)通过二硫键形成异源二聚体，IL-12p40可以与p35和p19分别形成IL-12和IL-23，也可以自生形成同源二聚体p80，与此同时p80在各个研究门类中都发挥重要作用。但是，综合而言，鱼类尤其是花鲈的IL-12p40的研究较少且不全面。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA及其编码蛋白的氨基酸。本专利技术的第二个目的在于提供含有上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA的表达载体。本专利技术的第三个目的在于提供一种花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白的制备方法及由该方法制备的花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白。本专利技术的最后一个目的在于提供上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白及重组蛋白在制备具有抑制和杀害细菌功效的药物中的应用。所以，本专利技术主要涉及花鲈白细胞介素12亚基IL-12p40(以下简称IL-12p40)基因的cDNA序列、编码蛋白的氨基酸序列、时空表达图谱，体外重组蛋白的制备方法、重组蛋白，功能验证方法，本专利技术还涉及该基因的应用途径。本专利技术的上述第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA，它的核酸序列如SEQIDNO.1所示。上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA，其具体通过在花鲈转录组中筛选获得花鲈白细胞介素IL-12p40的部分序列，在对目的基因的部分序列进行验证后，设计PCR引物。利用cDNA末端快速扩增(RapidAmplificationofcDNAends,RACE)技术对目的基因的3ˊ和5ˊ末端进行PCR扩增获得花鲈IL-12p40基因的全长序列。来自花鲈白细胞介素IL-12p40基因的全长cDNA序列为1386bp，含有开放阅读框(ORF)为966bp，包括82bp的5'-非编码区(5'-UTR)，起始于ATG，338bp的3'-非编码区(3'-UTR)，终止于TAG，具有poly(A)尾巴。该基因编码321个氨基酸，分子量34.6kDa，PI为6.0。在所有实验组织中，花鲈白细胞介素IL-12p40基因被普遍检测到，并且在免疫组织中普遍高表达。表明在生理过程中起持续起作用。本申请专利技术人选择头肾、脾脏和肝脏作为目标组织，用细菌刺激(哈维氏弧菌和无乳链球菌)处理后，结果显示该基因在免疫器官中表达量明显升高。该基因在免疫器官中高表达，并在细菌感染时期具有一定的抑制和消除作用，预示着该基因在抗菌生理过程中起重要作用。本专利技术的上述第二个目的是通过如下技术方案来实现的：包括上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA的表达载体。显然的，该表达载体也包含上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的ORF序列。本专利技术的上述第三个目的是通过如下技术方案来实现的：一种花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白的制备方法，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白。其中，本专利技术所述的寄主细胞优选是原核或真核细胞。进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术提供的一种花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白的步骤的方法制备。本专利技术的上述第四个目的是通过如下技术方案来实现的：上述花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白在制备具有抗菌和增强鱼免疫力功效的药物中的应用。进一步的，上述花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白在制备具有抗菌和增强鱼免疫力功效的在药物中的应用。本专利技术通过固体平板抑菌圈实验，将圆形纸片浸在纯化的花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白及重组蛋白中，并且将纸片置于铺满细菌的平板上，计算具体的抑菌圈直径。通过液体细菌抑制试验，将重组蛋白注射到细菌的培养基中，经过一段时间观察抑制效果。结果表明：花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白和花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白都有抑菌效果，并且花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白的抑菌效果要优于花鲈白细胞介素IL-12p40蛋白。本专利技术进一步注射及未经过注射花鲈白细胞介素IL-12p40蛋白及重组花鲈白细胞介素IL-12p40蛋白后再注射细菌(溶藻弧菌和嗜水气单胞菌)后进行死亡率统计，确定其在抗菌过程中的实际效果。结果表明：花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白和花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白实验组的死亡率低于对照组，花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白实验组的死亡率要低于花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白。所以，花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA是从花鲈中分离出序列。花鲈IL-12p40的cDNA编码321个氨基酸多肽，具有1386个碱基对(bp)。编码翻译形成的蛋白有保守的白细胞家族结构域特征IL-12p40c。从系统发育分析和序列图中可以看出，花鲈IL-12p40在花鲈白细胞介素家族中属于典型的IL-12/IL-6家族成员。和免疫系统有着很强的联系。对于转录水平，花鲈IL-12p40的mRNA在各组织中被普遍检测到，表明其在花鲈生理过程中起关键作用。科学研究还表明，通过细菌应激实验，花鲈IL-12p40在消除由病毒或细菌感染介导的免疫反应和炎症过程中起着关键作用。但是，综合而言，鱼类尤其是花的IL-12p40的研究较少且不全面。本研究提供了花鲈IL-12p40基因在对虾中具有应对各种毒物因子的有用信息，有助于进一步探索花鲈IL-12p40的功能机制，可作为应用于生态毒理学的新型分子生物标准物，或作为鱼类抗病或增强鱼类免疫力药物使用，有助于了解多种生理机制。本专利技术的有益效果是：本专利技术从花鲈转录组中获得一个新的花鲈IL-12p40的cDNA序列，通过生物基因工程技术对其功能探索，发现该序列在真核或原核细胞中可以高效表达；本专利技术还将上述花鲈IL-12p40的cDNA序列克隆到原核或真核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，通过阳性克隆子的积极诱导表达得到其重组蛋白，研究其性质发现，花鲈IL-12p40基因在免疫组织中特异性高表达，其重组纯化蛋白对细菌具有抑制生长和杀菌作用，在花鲈活体注射实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种花鲈白细胞介素IL‑12p40基因的cDNA，其特征是：它的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种花鲈白细胞介素IL-12p40基因的cDNA，其特征是：它的核酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的花鲈白细胞介素IL-12p40基因的编码蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包括权利要求1所述的cDNA的表达载体。4.一种花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白的制备方法，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得花鲈白细胞介素IL-12p40重组蛋白。5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的寄主细胞是原核...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽华，王鹏飞，赵超，闫路路，范嗣刚，陈祥，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。