用于检测转运的生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测转运的生物传感器及其应用。具体地，本发明专利技术的方法包括步骤：(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：(a1)一生物传感器；(a2)一检测溶液；(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和(e)检测，从而获得所述待测物的转运检测结果；或获得所述待测物对转运体影响的结果。本发明专利技术操作简便、检测高效快速。

Biosensor for detecting transport and its application

The invention provides a biosensor for detecting translocation and its application. Specifically, the method of the invention comprises steps: (a) providing a detection system, wherein the detection system comprises: (a) a biosensor; (a) a detection solution; (b) mixing the detection system with the substance to be tested and the transport inhibitor, or mixing the detection system with the substance to be tested and the transport substrate, from The first mixed solution is formed; (c) the first mixed solution is optionally placed for a period of time t; (d) the biosensor is separated from the first mixed solution to obtain the separated biosensor; and (e) the detection is performed to obtain the transport detection result of the substance to be measured; or the substance to be measured is obtained. The impact on transporters. The invention has simple operation and high efficiency.

【技术实现步骤摘要】
用于检测转运的生物传感器及其应用
本专利技术属于生物
，具体地涉及用于检测转运的生物传感器及其应用。
技术介绍
物质的转运与众多生理活动有关。ATP结合盒转运体是目前研究较多的一类超家族转运体，由两个跨膜结构域及两个细胞质ATP结合域组成，其底物非常广泛，参与胆汁盐、核苷、胆固醇、肽、多种药物、氯离子、毒素、有机阴离子、铁、以及固醇等多种内源和外源性底物的转运。目前已经发现49种人的ABC转运蛋白成员，分为七个亚家族(ABC-A至ABC-G)。一些外排型转运体往往与很多药物的耐药现象密切相关，因此，ABC转运蛋白被认为是克服肿瘤耐药治疗的重要靶标。例如，肿瘤耐药的最主要原因之一是ATP结合盒转运蛋白超家族的成员以能量依赖的方式从细胞中泵出多种结构上不相关的抗肿瘤药物，如紫杉醇、环霉素、蒽紫杉烷、长春花生物碱等，从而降低细胞内的药物浓度，减弱药物的疗效。除了肿瘤药物之外，在许多其他药物的研究中，也需要对转运功能进行研究。然而，目前缺乏令人满意的在体外高效准确地对生物转运功能进行检测的方法。因此，本领域迫切需要开发能够高效而准确地对生物转运功能进行检测的方法，以满足高通量筛选的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种能够高效而准确地对生物转运功能进行检测的生物传感器及其制法和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种在体外对待测物进行转运检测的方法，所述方法包括步骤：(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，并且所述的细胞选自下组：小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、或其组合；(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器；(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物对转运体影响的结果。在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(b)中，将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；以及将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，形成第一混合液。在步骤(e)中，检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。在另一优选例中，所述的生物传感器是对干细胞进行定向培养而形成的。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。在另一优选例中，所述的细胞来自哺乳动物。在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠)、非人灵长动物。在另一优选例中，所述的体外方法是对药物的耐药性进行评价的方法。在另一优选例中，所述的待测物选自下组：小分子化合物、提取物、miRNA、或其组合。在另一优选例中，所述的待测物为药物。在另一优选例中，所述的待测物为抗肿瘤药物。在另一优选例中，所述检测体系位于一个容器或一个孔中。在另一优选例中，所述的生物传感器的数量为50-100个/孔。在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔。在另一优选例中，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.001-200μM，较佳地0.01-100μM，更佳地0.1-50μM，最佳地5-20μM。在另一优选例中，所述的生物传感器具有选自下组的一个或多个特征：(i)平均直径为50-200μm，较佳地70-120μm；(ii)内部富集腔的大小为2×105μM3至1.5×107μM3，较佳地为1×106μM3至5×106μM3。在另一优选例中，在步骤(c)中，所述时间t为0.1-72小时。在另一优选例中，在步骤(d)中，所述分离包括：离心、静置、或其组合。在另一优选例中，在步骤(e)中，包括：(e1)对分离的生物传感器进行清洗；(e2)用PBS进行孵育以进行释放处理，从而释放所述生物传感器的内部富集腔内的所述待测物和/或所述转运底物；(e3)对释放处理后的混合物取上清；和(e4)对所述上清中的所述待测物和/或转运底物进行检测。在另一优选例中，在步骤(e)中，对所述待测物和/或转运底物进行浓度检测。在另一优选例中，所述的浓度检测包括步骤：(e1)将经分离的生物传感器进行破碎处理，从而将内部富集腔内的所述待测物和/或转运底物释放出；(e2)将含所述待测物和/或转运底物的上清转移置另一容器(如96孔板)；和(e2)测定所述经释放的待测物和/或转运底物的浓度。在另一优选例中，所述的检测包括荧光检测或LC-MS/MS。在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为0.01-100μM，较佳地1-50μM，更佳地5-20μM。在另一优选例中，所述的转运底物为荧光底物或发光底物。在另一优选例中，所述的转运底物选自下组：CDF、奥美沙坦、或其组合。在另一优选例中，所述的方法还包括与阳性对照组进行比较。在另一优选例中，所述的阳性对照组采用选自下组的抑制剂作为阳性对照物：probenecid、MK-571、杨梅酮、或其组合。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。在本专利技术的第二方面，提供了一种用于在体外对待测物进行转运检测的检测体系，所述检测体系包括：(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，其中所述的细胞选自下组：小肠绒毛细胞、潘氏细胞、或其组合；(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器和任选的转运底物。在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔。在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的转运底物的浓度为0.01-100μM，较佳地1-50μM，更佳地5-20μM。在另一优选例中，所述的转运底物为荧光底物或发光底物。在另一优选例中，所述的转运底物选自下组：CDF、奥美沙坦、或其组合。在另一优选例中，所述的检测体系还含有：待测物。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了在本专利技术一个实施例中经培养分化所形成生物传感器。其中，隐窝经3天的培养分化形成囊状的生物传感器，隐窝中的干细胞开始分化“出芽”形成新的隐窝结构。图2显示了在小鼠小肠绒毛、隐窝以及体外培养分化的生物传感器中MRP2mRNA的表达；以及MRP2在不同培养天数的的生物传感器中mRNA表达水平。图3显示了小鼠小肠和生物传感器中MRP2蛋白水平检测结果。箭头标记为MRP2的表达位置，MRP2蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在体外对待测物进行转运检测的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，并且所述的细胞选自下组：小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、或其组合；(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器；(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物对转运体影响的结果。

【技术特征摘要】
1.一种在体外对待测物进行转运检测的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一检测体系，其中，所述的检测体系包括：(a1)一生物传感器，所述生物传感器具有一内部富集腔，以及围绕所述内部富集腔的腔体层，所述的腔体层包括多层细胞，并且所述的细胞选自下组：小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、或其组合；(a2)一检测溶液，其中所述的检测溶液中含有所述的生物传感器；(b)将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，或者将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；(c)任选地将所述第一混合溶液进行放置一段时间t；(d)将所述生物传感器与所述第一混合溶液进行分离，从而获得经分离的生物传感器；和(e)检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述待测物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果；或者检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物对转运体影响的结果。2.如权利要求1所述的方法，在步骤(b)中，将所述检测体系与待测物和转运底物进行混合，从而形成第一混合溶液；以及将所述检测体系与待测物和转运抑制剂进行混合，形成第一混合液。3.如权利要求1所述的方法，在步骤(e)中，检测在所述的经分离的生物传感器的内部富集腔内的所述转运底物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测物的转运检测结果。4.如权利要求1所述的方法，所述的生物传感器是对干细胞进行定向培养而形成的；在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的；在另一优选例中，所述的细胞来自哺乳动物；在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物；在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠)、非人灵长动物；在另一优选例中，所述的体外方法是对药物的耐药性进行评价的方法。5.如权利要求1所述的方法，所述的待测物选自下组：小分子化合物、提取物、miRNA、或其组合；在另一优选例中，所述的待测物为药物；在另一优选例中，所述的待测物为抗肿瘤药物。6.如权利要求1所述的方法，所述检测体系位于一个容器或一个孔中；在另一优选例中，所述的生物传感器的数量为50-100个/孔；在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的生物传感器的数量为10-500个/孔，较佳地20-200个/孔，更佳地50-100个/孔；在另一优选例中，在步骤(b)中，在所述第一混合溶液中，所述待测物的浓度为0.001-200μM，较佳地0.01-100μM，更佳地0.1-50μM，最佳地5-20μM；在另一优选例中，所述的生物传感器具有选自下组的一个或多个特征：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕，张磊，张远金，刘明耀，席在喜，
申请(专利权)人：华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31