The invention discloses a method for enriching trace silk fibroin, which comprises the following steps: 1) mixing of monoclonal antibodies against different silk fibroin proteins; 2) coupling reaction; 3) obtaining immunomagnetic beads; 4) identification; 5) immobilization of silk fibroin monoclonal antibodies against coupled immunomagnetic beads; 6) immunomagnetic beads against silk fibroin monoclonal antibodies Binding to silk fibroin; 7) silk fibroin elution; 8) detection; 9) recovery by standard addition. The invention uses the composite monoclonal antibody of silk fibroin to prepare the immune magnetic beads, and uses the immune magnetic beads to enrich trace silk fibroin, which can better extract trace silk fibroin from archaeological soil samples, and has the advantages of extracting different decomposition fragments, high enrichment efficiency, simple operation, short experiment time and so on.
【技术实现步骤摘要】
一种痕量丝素蛋白富集方法
本专利技术涉及生物
,具体涉及一种痕量丝素蛋白富集方法。
技术介绍
丝绸作为中华文明的重要专利技术之一,承载着极其丰富的文化、技术和社会内涵,为考古学、历史学、技术史的研究提供了珍贵的资料。已出土的丝绸残片表明丝绸的起源应不晚于5500年前。然而,从发现蚕丝纤维到将其织造成精美的丝绸必然需要长时间的发展。因此,我们的祖先开始使用蚕丝纤维的时间远早于5500年前。但是,丝绸的起源问题一直笼罩在迷雾中。如何利用科学的手段确定丝绸起源并源自中国,具有十分重要的历史和文化价值。丝绸由蚕丝织成,蚕丝是由18种氨基酸构成的天然蛋白质纤维。在漫长的历史进程中,当年埋入墓葬或遗址中的丝织品早已失去了实体面貌,降解成肽段和氨基酸,或者成为痕迹,或者化入泥土,在肉眼下已经无法辨识,且年代越早的证据越难寻觅。如何在丝绸宏观形态消失的情况下探寻更早的证据成为了研究早期丝绸的关键问题。相对于完整的丝织物,无形的纤维丝素蛋白残留物更有可能保存下来,也有可能成为探寻早期蚕丝遗存的新证据。在长达数百年甚至数千年的时间长河中,考古材料中剩余的丝绸含量微乎其微,因此在对样品进行检测之前进行考古材料中痕量丝素蛋白进行富集,以提高检测的准确性,同时又要考虑的操作上的简便以及耗时少的问题。目前进行痕量丝素蛋白的检测有多种方法,其中ELISA检测方法是利用抗原抗体的特异性结合进行检测,是丝素蛋白生物检测的最新技术,但ELISA检测方法需要检测目的物丝素蛋白能够有一定的浓度,而在考古发掘样品中的丝蛋白经过长期的岁月和环境的侵蚀,土中剩余的丝素蛋白含量微乎其微,而且可能被 ...
【技术保护点】
1.一种痕量丝素蛋白富集方法,其特征在于包括以下步骤:不同丝素蛋白单克隆抗体的混合:取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合;耦联反应:取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入步骤1)中制备的混合抗体70μg,置于振荡器上室温耦联反应过夜;免疫磁珠的获得:用磁力架收集步骤2)中偶联反应后的磁珠并去除上清液,得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠;鉴定:另取1mg未偶联的磁珠和步骤3)中偶联后的磁珠在55‑65℃下烘干,进行傅里叶红外检测,观察1541cm‑1处的特征峰,确定耦联状态;耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化:在步骤3)中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液,三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯,混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,在室温孵育30min;孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液,接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交 ...
【技术特征摘要】
1.一种痕量丝素蛋白富集方法,其特征在于包括以下步骤:不同丝素蛋白单克隆抗体的混合:取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合;耦联反应:取蛋白G包裹磁珠1mg加入到1mL、pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入步骤1)中制备的混合抗体70μg,置于振荡器上室温耦联反应过夜;免疫磁珠的获得:用磁力架收集步骤2)中偶联反应后的磁珠并去除上清液,得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠;鉴定:另取1mg未偶联的磁珠和步骤3)中偶联后的磁珠在55-65℃下烘干,进行傅里叶红外检测,观察1541cm-1处的特征峰,确定耦联状态;耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化:在步骤3)中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液,三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯,混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,在室温孵育30min;孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液,接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠2-4次,然后再用1mL的磷酸盐吐温缓冲液洗涤磁珠1-3遍,最后用1mL含0.02%NaN3、0.1%牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬磁珠,并保存于4℃冰箱;丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合:把步骤5)最终得到的免疫磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,在常温下孵育1h;每毫升免疫磁珠中加入含有10~100ng的丝素蛋白样品,置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,并在25℃反应60min;然后用磁力架收集磁珠并去除上清液,接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联...
【专利技术属性】
技术研发人员:戴贤君,郑海玲,马超,周扬,
申请(专利权)人:中国计量大学,中国丝绸博物馆,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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