一种香樟SSR引物组合及其品种鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种香樟SSR引物组合物及其品种鉴定方法，用于香樟品种的快速分子检测与鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。本发明专利技术设计了4对SSR引物，并利用它们成功构建了11个香樟品种指纹图谱，可快速、准确地区分各香樟品种。本发明专利技术基于4对SSR引物，进行一次PCR扩增反应，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，利用引物组合法，可直接根据产物的片段进行判断。本发明专利技术可直接应用于香樟不同品种的分子鉴定，具有很好的实用性。

A SSR primer combination and identification method of Cinnamomum camphora

The invention discloses a camphor SSR primer composition and a variety identification method thereof, which are used for rapid molecular detection and identification of camphor varieties and belong to the field of molecular identification of new plant varieties. Four pairs of SSR primers were designed, and 11 camphor varieties fingerprints were successfully constructed by using them, which can quickly and accurately distinguish different camphor varieties. Based on four pairs of SSR primers, the invention carries out a PCR amplification reaction, uses 8% polyacrylamide gel for electrophoresis, and uses primer combination method to judge directly according to the fragments of the products. The invention can be directly applied to molecular identification of different varieties of Cinnamomum camphora, and has good practicability.

【技术实现步骤摘要】
一种香樟SSR引物组合及其品种鉴定方法
本专利技术属于植物新品种鉴定
，涉及一种香樟SSR引物组合物及其品种检测方法，专用于不同香樟品种的分子检测和鉴定。
技术介绍
香樟(Cinnamomumcamphora)是樟科樟属的常绿阔叶大乔木，是国家II级重点保护植物。香樟生长迅速，树冠开展，树形美观，可作绿化行道树，或栽植为园景树。樟籽含有丰富的油脂，可以直接应用于化妆品中；叶片含有的樟油，可用来提炼樟脑或制成化学原料；木材具有耐腐蚀、密度高、带有浓郁香气的特质，是制作家具和木材雕刻艺术品上佳材料，深受人们的青睐。同时，除具有材性优良、冠型优美等特点外，叶片中富含的次生代谢物具有一定药用价值，故香樟是我国珍贵用材树种和经济树种。香樟“赣彤”为江西省科学院生物资源研究所选育的红杆香樟，主要表现为茎杆全年为红色，且叶色随着季节产生变化；“霞光”为浙江宁波市林业局林特种苗繁育中心的红叶樟树，春天时叶片外红里白，夏天时变成外白里红。简单序列重复(simplesequencerepeats，SSRs)，又称为微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸串联重复数次组成的核苷酸序列。其长度一般在100bp以下，广泛分布于植物基因组内，而重复次数的不同及重复程度的不完全则赋予SSR位点丰富的多态性。同时，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富等优点，是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传结构、不同品种分子鉴定的理想工具。然而，SSR标记在香樟品种分类和鉴定方面的应用尚未见报道，故现需建立一种快速、准确鉴定香樟品种的分子手段，以更好的保护和利用香樟品种资源。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种香樟SSR分子检测引物组合物，克服以往香樟品种鉴定方法存在的缺陷，提供准确可靠、易于操作、灵敏度高的分子检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种使用香樟品种分子检测引物组合物快速检测香樟品种方法，该方法可以直接应用于生产实践，对于香樟苗木的鉴定具有十分重要的意义。技术方案：为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种香樟品种分子鉴定引物组合物，由4对引物组成，其引物序列如下表所示：。应用所述的香樟品种分子检测引物组合物构建香樟品种指纹代码，所获得的11个香樟品种对应指纹代码如下表所示：。一种应用所述的引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA2)使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对待测香樟样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定待测样品的品种。步骤1)中，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒完成待测样品DNA提取。步骤2)中，10μLPCR扩增反应体系包括：1μ10×Buffer；0.75mMMgCl2；0.025mMdNTPs；1UTaqDNA聚合酶；0.4μMSSR引物和30ngDNA模板。步骤2)中，PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。步骤3)中，依据待测样品PCR产物判读情况，对照品种指纹代码，鉴定待测样品。所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，香樟品种共计为11个，分别为：赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下的优势：1)结果高度准确、可靠：本专利技术所用香樟材料来自江西，为香樟的主要生产区，并利用本专利技术进行检测与鉴定，检测结果100％准确，为检测结果提供了高度的可靠性。2)操作简便快速：本方法提取样本DNA后，进行PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可以判断结果，一般整个检测过程可在6个小时内完成。3)取材方便、实用价值明显：本方法采样方便，叶片、芽、花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点、取样部位等因素的限制。4)通过对香樟苗木进行分子鉴定可以避免苗木生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于香樟不同品种的苗木生产与销售具有十分重要的经济效益。附图说明图1是第1对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；图2是第2对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；图3是第3对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；图4是第4对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1采用IlluminaHiSeq2500测序平台，对香樟叶片DNA进行测序得到香樟转录组序列，利用MISA软件对所得序列进行SSR位点的寻找，随机挑选100个SSR位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，有74对引物能够稳定扩增。从香樟品种材料中随机选取6个个体对可稳定扩增的74对SSR引物进行多态性检测，最后获得了21对转录组SSR多态引物；随后，从中选取多态性表现良好，且条带清晰的7对SSR引物，11个香樟品种进行PCR扩增。应用POPGENE进行相关遗传参数计算，依据PIC值(多态性信息含量)、Shannon多样性指数以及Na值，最终选择4对扩增稳定、多态性好、重复性高的引物进行排列组合，构建指纹代码。该4对SSR引物即为本专利技术的香樟分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示。表1香樟品种分子检测引物实施例2应用实施例1的香樟品种分子检测引物组合物构建香樟品种指纹代码，简要构建过程如下：1)PCR扩增及产物检测：利用实施例1筛选出的4对多态性SSR引物对11个香樟品种进行PCR扩增。所得产物利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测。10μL反应体系中包括：1μ10×Buffer；0.75mMMgCl2；0.025mMdNTPs；1UTaqDNA聚合酶；0.4μMSSR引物和30ngDNA模板。PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。2)数据处理：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果读取采用大写英文字母表示，同一对引物而言，对不同模版的扩增产物会因其片段大小的不同而在电泳过程中表现为迁移速度的不同，在相同时间内，移动到同一位置的若干条带便认为是同一个等位基因。依据条带大小从大到小依次用字母A、B、C、D等表示。图1、2、3、4分别为本实施例中的4对SSR引物利用相同模板进行扩增所得产物的聚丙烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香樟品种分子鉴定引物组合物，其特征在于，由4对引物组成，其引物序列如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种香樟品种分子鉴定引物组合物，其特征在于，由4对引物组成，其引物序列如下表所示：。2.应用权利要求1所述的香樟品种分子检测引物组合物构建香樟品种指纹代码，其特征在于：所获得的11个香樟品种对应指纹代码如下表所示：。3.一种应用权利要求1所述的引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品DNA2)使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对待测香樟样本进行PCR扩增；3)PCR产物则利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定待测样品的品种。4.根据权利要求3所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，步骤1)中，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒完成待测样品DNA提取。5.根据权利要求3所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟永达，胥猛，郦芝汀，余发新，徐立安，
申请(专利权)人：江西省科学院生物资源研究所，南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36