一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，目的是提高EMS对大花萱草离体诱变效率；本发明专利技术以生长发育正常的1‑2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基胁迫处理愈伤组织30‑60分钟；取出愈伤组织后直接用浓度为0.75‑1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1‑2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。
【技术实现步骤摘要】
一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法
本专利技术涉及一种花木——大花萱草EMS（甲基磺酸乙酯）离体诱导突变体发生的方法，具体为一种利用高渗透固体培养基胁迫处理愈伤组织，提高EMS离体诱变效率的技术方法。萱草(Hemerocallishybrida)是百合科(Liliaceae)萱草属多年生宿根草本。是集食、药和观赏为一体的植物品种。近年来国内陆续引进了一些观赏性大花萱草新品种，其叶似兰，花如百合。有淡黄、金黄、鹅黄、大红、粉红、复色等十几种花色，艳丽缤纷；花型多姿，有单瓣、重瓣、花瓣反卷，婀娜多姿，具有极高的园林观赏价值。大花萱草在北方干燥寒冷地区表现出极好的栽培特性：它具有短根状茎和肉质肥厚的纺锤状块根，耐旱性、耐寒性极强，大量用做地被植物，部分替代草坪；它管理粗放，养护成本是草坪草的1/5，是优秀的园林绿地花卉，其优良的耐旱耐寒性和高雅多色的观赏性受到广泛的认可。萱草的育种研究十九世纪就在欧美兴起。二十世纪以来采用传统的杂交育种方式，培育出了很多优秀的萱草园艺新品种。至今，园艺品种已多达6万余种。上世纪50年代到80年代，人们通过杂交育种的方法培育出多花色、皱褶和重瓣的萱草品种。随后，育种方向开始转向多倍体育种。随着四倍体萱草的培育成功，萱草品种得到了极大的丰富，成为品种最丰富的宿根花卉之一。国内萱草育种研究主要集中在杂交亲和性、生殖隔离和野生资源的开发利用方面。育种目标重点集中在花色、花型、花香和花期变化方面。育种方式多采用杂交育种和倍性育种方法。随着植物组织培养技术的不断完善，利用萱草组织或器官离体培养法结合秋水仙素诱导多倍体的方法使育种效率大大提高。化学诱变育种是一种人为的利用化学诱变剂诱发植物的遗传变异，可以有效克服杂交不亲和性和生殖隔离的现象，在短时间内获得有利用价值的突变体材料，再根据育种目标的需要定向筛选获得新品种并稳定遗传后用于生产应用。随着细胞工程技术的快速发展，化学诱变和离体组织培养技术相结合，具有不受大田环境影响周年进行，缩短育种时间、扩大变异谱和提高变异率的优点。甲基磺酸乙酯（Ethylmethanesulfonate，EMS）作为化学诱变剂是通过与核苷酸中的磷酸、嘧啶和嘌呤直接反应来诱发点突变，在很多植物上都获得了不同类型的突变体，在很多农作物和园林植物的改良上得以应用。罗静采用0.2%EMS浸泡处理1hrs草莓三种愈伤组织块，其中以直接产生的愈伤组织诱导效果最佳，产生抗灰霉病突变体。杨媚以香蕉愈伤组织和分化芽为受体，0.5%EMS处理40min，获得“半致死剂量效应”，通过香蕉枯萎病菌梯度胁迫选择获得抗香蕉枯萎病菌毒素的愈伤组织块和分化芽。蔡海燕等利用EMS的诱变作用处理菊花茎尖，突变群体的表型变异率达到6.31%，诱变效果十分明显。通过EMS离体诱变的方法诱导突变体的产生是一种育种新途径。该方法的应用，首先要建立一个高效的组织培养体系，提高EMS的诱变效率。影响愈伤组织培养的因素有很多，在愈伤组织诱导和基因的遗传转化方面的研究有报道。刘燕蓉在农杆菌介导柳枝稷遗传转化体系中采用了“渗透冷处理+真空+干燥”的处理方法使农杆菌转化效率提高了约15-20%。陈军营、廖祥儒采用PEG对小麦预处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成具有显著的促进作用。大花萱草的离体诱变育种及如何采用预处理的方法提高诱变效率的研究均未见报道。本研究是以大花萱草愈伤组织为受体材料，通过在固体培养基中添加渗透调节物甘露醇、山梨醇和高浓度蔗糖进行渗透胁迫预处理的方法，提高EMS诱变率。
技术实现思路
本专利技术目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可提高EMS对大花萱草离体诱变效率、为大花萱草育种提供新的技术方法和技术体系的高渗透固体培养基胁迫处理带芽愈伤组织提高EMS离体诱变率的方法。本专利技术利用渗透胁迫处理提高大花萱草EMS（甲基磺酸乙酯）离体诱变率的方法的具体步骤是：（1）以生长发育正常的1-2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；（2）带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8g/L，胁迫处理愈伤组织30-60分钟；（3）取出愈伤组织后直接用浓度为0.75-1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；（4）处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；（5）以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。以生长发育正常的1-2cm大花萱草花蕾为材料，无菌条件下用0.1%浓度的HgCl2消毒灭菌，无菌水冲洗3-4次；无菌条件下剥离花瓣，露出子房，横切成薄片，接种于愈伤组织诱导培养基；25℃，暗培养条件下26-28天，诱导愈伤组织产生；愈伤组织诱导培养基为：MS全量+2mg/L2,4-D+1mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。将子房诱导出的愈伤组织接种于分化培养基上，25℃，光照培养，光照强度2000Lux，待愈伤组织分化出绿色小芽；将已分化出绿色芽点的愈伤组织切割为0.3-0.5cm3大小，继续分化培养10天的带芽愈伤组织作为高渗透处理和EMS诱变的受体材料；愈伤组织分化培养基为：MS全量+0.5mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。已分化出绿色小芽、分割成0.3-0.5cm3并继代培养10天的愈伤组织接入含有渗透调节剂甘露醇、山梨醇和蔗糖的高渗透T固体培养基静置培养30-60分钟；而后，将经过高渗透培养的愈伤组织直接进行EMS诱变处理；高渗透T固体培养基：MS全量+0.5mg/L6BA+0.2mg/IBAL+36g/L甘露醇+36g/L山梨醇+50g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。0.75—1.0%（w/v）浓度的EMS半致死剂量是用0.05M的pH7.0的磷酸缓冲液配置成EMS浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液。是无菌条件下，将经过高渗透T固体培养基培养30-60分钟的愈伤组织转接进浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液中，以28℃、150转/分，振荡培养1小时为EMS诱变处理方法。诱变处理后的带芽愈伤组织在无菌条件下用无菌蒸馏水冲洗3-4次，滤纸吸干水分，接入愈伤组织分化培养基，25℃、光照分化培养；淘汰死亡的愈伤组织，成活的愈伤组织继续分化培养，获得突变体再生植株。待突变体再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下在继代培养基上培养15天。转接进经过毒性检测的40%（v/v）浓度的粗萱草叶枯病菌毒素的继代培养基，25±1℃，16h光/8h暗，光照强度2800lx培养21天，进行选择压胁迫筛选；淘汰死亡植株，成活植株转入生根培养基，生根培养成为完整的抗病突变体材料。继代培养基：MS全量+1.0mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉pH5.8；选择压筛选培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是：（1）以生长发育正常的1‑2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；（2）带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8g/L，胁迫处理愈伤组织30‑60分钟；（3）取出愈伤组织后直接用浓度为0.75‑1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；（4）处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1‑2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；（5）以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。
【技术特征摘要】
1.一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是：（1）以生长发育正常的1-2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；（2）带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8g/L，胁迫处理愈伤组织30-60分钟；（3）取出愈伤组织后直接用浓度为0.75-1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；（4）处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；（5）以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。2.如权利要求1所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是以生长发育正常的1-2cm大花萱草花蕾为材料，无菌条件下用0.1%浓度的HgCl2消毒灭菌，无菌水冲洗3-4次；无菌条件下剥离花瓣，露出子房，横切成薄片，接种于愈伤组织诱导培养基；25℃，暗培养条件下26-28天，诱导愈伤组织产生；愈伤组织诱导培养基为：MS全量+2mg/L2,4-D+1mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。3.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是将子房诱导出的愈伤组织接种于分化培养基上，25℃，光照培养，光照强度2000Lux，待愈伤组织分化出绿色小芽；将已分化出绿色芽点的愈伤组织切割为0.3-0.5cm3大小，继续分化培养10天的带芽愈伤组织作为高渗透处理和EMS诱变的受体材料；愈伤组织分化培养基为：MS全量+0.5mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。4.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽莉，刘化涛，杨睿，闫六英，畅平，
申请(专利权)人：山西省农业科学院旱地农业研究中心，
类型：发明
国别省市：山西,14
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