一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法技术

本发明专利技术公开了一种用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，它包括两部分：(1)静息细胞的制备，是将以斜面形式保存的醋酸菌接种到传代培养基上进行活化，再将活化后的培养物转接到平板上制备大量的单菌落或菌苔。收集单菌落和菌苔，用无菌生理盐水洗涤、重悬、离心两次后，制备静息细胞；(2)利用上述的醋酸菌静息细胞催化合成细菌纤维素，在一定的条件下进行静置培养，培养结束后得到细菌纤维素膜。该方法具有反应过程简单可控、催化效率高、环境友好、经济节约等优点，具有重要的工业价值和较高的经济效益。

A method for producing bacterial cellulose catalyzed by resting cells of Acetobacter

The invention discloses a method to catalyze the production of bacterial cellulose with Acetobacter resting cells. It includes two parts: (1) the preparation of resting cells, which is activated by inoculating acetic acid bacteria in the form of a slant form on the passage culture medium, and then transferring the activated culture to the plate to prepare a large number of single colonies or fungi. The resting cells were prepared by the aseptic saline washing, suspension and centrifugation for two times. (2) the cellulose acetate was synthesized by the aforementioned Acetobacter resting cells. The bacterial cellulose membrane was cultured under certain conditions, and the bacterial fibroin membrane was obtained after the culture. The method has the advantages of simple and controllable reaction process, high catalytic efficiency, friendly environment, economical saving and so on. It has important industrial value and high economic benefit.

【技术实现步骤摘要】
一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法
本专利技术属于微生物和发酵工程
，涉及细菌纤维素的合成方法，具体涉及一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法。
技术介绍
19世纪末，英国科学家布朗在实验时首次发现细菌纤维素。细菌纤维素和植物纤维素一样，都是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来形成的大分子，而相较于植物纤维素，细菌纤维素有许多独特的性质。首先，细菌纤维素的纯度很高，几乎不含有半纤维素、木质素和果胶等杂质；其次，细菌纤维素的弹性模量很高，一般是植物纤维素的的数倍乃至十数倍，高弹性模量赋予了细菌纤维素抗张强度高的特性；细菌纤维素具有极强的吸水性和透水透气性，能吸收60-700倍其干重的水分；细菌纤维素具有较高的生物相容性、适应性和良好的生物可降解性；最后，细菌纤维素在合成过程中具有可调控性，可根据要求，对细菌纤维素进行性质改造。现在，细菌纤维素已广泛应用于食品、造纸、医药等领域，取得了很大的经济效益。采用微生物发酵法合成细菌纤维素时，由于醋酸菌代谢、繁殖的固有特点和发酵方式的限制，存在产量低、副产物浓度高、发酵液pH降低速度快、纤维素膜中杂质多、后处理繁琐等缺点。除了微生物发酵法，体外酶催化法也是一种重要的实验方法。细菌纤维素的合成过程中涉及4种不同的酶，选择酶催化法需要对细胞破碎后形成的粗酶液进行一定程度的纯化，不仅费时费力，酶活的损失也较为严重。静息细胞催化法是一种介于微生物发酵法和体外酶催化之间的实验技术，相较于前两种方法具有较高的技术优势，如副产物产量低、无需严格的无菌操作、酶的半衰期长等。
技术实现思路
专利技术目的：针对目前发酵法生产细菌纤维素面临产量低、价格高等问题，提供一种利用汉逊氏葡糖酸醋杆菌静息细胞催化合成细菌纤维素的方法，以提高细菌纤维素产量并降低生产成本的方法。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，以汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696静息细胞为催化剂，在反应液中催化制备细菌纤维素，所述反应液的配方如下：葡萄糖5-50g/L、磷酸氢二钠0-15g/L、pH4.0-7.0。其中，所述的醋酸菌为汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2016年11月29日。其中，所述汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696的活化方法如下：将汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696转接到传代培养基上，在25-35℃的条件下培养3～5d，优选30℃条件下培养3～5d。其中，所述传代培养基的配方如下：葡萄糖，20g/L；酵母粉，5g/L；蛋白胨，5g/L；磷酸氢二钠，2.7g/L；柠檬酸，1.15g/L；琼脂粉，20g/L，pH5.0，余量为水。其中，所述汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696静息细胞的制备方法如下：取汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696菌体置于生理盐水中，震荡使其分散，然后在10000r/min、4℃下离心10min，收集菌体，重复上述步骤两次，所得菌体即为汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696静息细胞。其中，在反应液中催化制备细菌纤维素的反应条件如下：温度25～35℃静置培养3～15d。其中，将发酵结束后体系表层形成的细菌纤维素膜取出，用蒸馏水冲洗，碱解，然后用蒸馏水和0.5％的乙酸冲洗，直至细菌纤维素膜呈中性，烘干，既得到细菌纤维素干膜。其中，所述碱解的条件如下：将细菌纤维素膜置于0.1mol/L的NaOH溶液中，在80℃的条件下浸泡2h。菌体的回收与再利用：细菌纤维素膜取出后，收集余下的反应液，在8000r/min、4℃的条件下离心10min，分别收集菌体和上清液。菌体用生理盐水重悬、洗涤后置于4℃冰箱中备用。测定上清液中的葡萄糖浓度，并将其pH调节至6.7，115℃下灭菌20min备用。将静息细胞重新接种到灭过菌的体系中，进行二次发酵乃至三次发酵，葡萄糖浓度低于3g/L或几乎不产BC膜时，舍弃反应液和静息细胞。有益效果：本专利技术具有如下优势：(1)操作简单，不涉及细胞破碎、酶的分离纯化等过程，简化了生产工艺和设备需求；(2)反应液中营养成分简单，不利于杂菌的繁殖与代谢，无需进行严格的无菌操作。细菌纤维素膜中，蛋白质等杂质的含量低，且颜色较浅，利于产物的分离纯化。附图说明图1静息细胞催化实验结果(10g/L)。图2静息细胞催化实验结果(15g/L)。图3静息细胞催化实验结果(20g/L)。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：反应液中的葡萄糖浓度为10g/L。(1)菌株活化：将保藏在传代培养基上的汉逊氏葡糖酸醋杆菌取出，以划线转接的方式接种到新的传代培养基上，在30℃下培养5d。(2)静息细胞制备：将活化好的菌株以相同的方法转接、培养，以获得足够的培养物，用接种环将平板上形成的单菌落和菌苔尽量挑出，置于生理盐水中，利用涡旋混合器尽可能使其分散，然后在10000r/min、4℃下离心10min收集菌体，洗涤、重悬、离心两次后，置于冰箱中备用。(3)反应液的制备：称取10g葡萄糖、2.7g磷酸氢二钠，用蒸馏水简单定容至1L，调节其pH至6.7左右，在115℃下灭菌15min备用。(4)接种与培养：将制得的静息细胞以5％的接种量(w/v)接种到反应液中，简单振荡后置于30℃下静置培养。(5)纤维素膜的收集与处理：催化结束后，将反应液表层形成的纤维素膜取出，用蒸馏水反复冲洗后，用0.1mol/L的NaOH溶液在80℃的条件下浸泡2h。碱解结束后，用蒸馏水和0.5％的乙酸反复冲洗，直至纤维素膜呈中性。将纯化过后的纤维素湿膜置于洁净平板上，置于80℃烘箱中至恒重，所得数值减去平板自重即得纤维素膜的干重。(6)葡萄糖残存浓度的测定：用SBA-40E型生物传感分析仪测定。(7)乙酸生成浓度的测定：采用高效液相色谱法，检测条件如下：色谱分析柱：Bio-RadHPX-87H；流动相：0.005mol/LH2SO4；柱温：65℃；流速：0.6mL/min；检测波长：217nm。(8)催化实验结果：一次催化反应结束后，得到的实验结果如图1所示。经过6d的静置培养，静息细胞在10g/L葡萄糖的反应液中，产生了4.12g/L的BC干重，同时产生了1.02g/L的副产物乙酸，乙酸和其它有机酸的产生，使得发酵液的pH降低至5.13，反应结束后，葡萄糖残存了2.87g/L，不足初始添加量的30％。在消耗的7.25g/L的葡萄糖中，有4.12g/L用来合成目标产物BC，葡萄糖转化率达到了56.83％。一次催化结束后，葡萄糖残存浓度仅为2.87g/L，达到了舍弃要求，故将静息细胞菌体和反应液菌舍弃。实施例2：反应液中的葡萄糖浓度为15g/L。(1)菌株活化：将保藏在传代培养基上的汉逊氏葡糖酸醋杆菌取出，以划线转接的方式接种到新的传代培养基上，在30℃下培养5d。(2)静息细胞制备：将活化好的菌株以相同的方法转接、培养，以获得足够的培养物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，以汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCC NO：M 2016696静息细胞为催化剂，在反应液中催化制备细菌纤维素，所述反应液的配方如下：葡萄糖5～50g/L、磷酸氢二钠0～15g/L、pH 4.0～7.0。

【技术特征摘要】
1.一种利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，以汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696静息细胞为催化剂，在反应液中催化制备细菌纤维素，所述反应液的配方如下：葡萄糖5～50g/L、磷酸氢二钠0～15g/L、pH4.0～7.0。2.根据权利要求1所述的利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696的活化方法如下：将汉逊氏葡糖酸醋杆菌CCTCCNO：M2016696转接到传代培养基上，在25-35℃的条件下培养3～5d。3.根据权利要求2所述的利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述传代培养基的配方如下：葡萄糖，20g/L；酵母粉，5g/L；蛋白胨，5g/L；磷酸氢二钠，2.7g/L；柠檬酸，1.15g/L；琼脂粉，20g/L，pH5.0，余量为水。4.根据权利要求1所述的利用醋酸菌静息细胞催化生产细菌纤维素的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊强，王延斌，宗丹，陈海超，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32