一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC制造技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC具在亚单位疫苗和核酸疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，制备所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的步骤具体包括，pMD18‑T‑tolC载体的构建，重组表达载体体pET‑32a‑tolC的构建，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达及验证，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化；利用Western blot检测迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，以及使用动物实验评估其免疫保护力。通过本发明专利技术公开的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。

An outer membrane protein TolC of Edward bacillus with immune protection

The invention discloses an application of the immune protective effect of the slow Edward bacteria outer membrane protein TolC in subunit vaccine and nucleic acid vaccine. The recombinant protein is prepared by the prokaryotic expression method and the steps of preparing the outer membrane protein TolC of the retarded Edward bacteria are included, and the construction of the pMD18 T tolC vector is heavy. The construction of the group expression vector pET 32a tolC, the prokaryotic expression and verification of the outer membrane protein TolC of Edward bacteria, the verification of the outer membrane protein TolC of the tarda, the soluble analysis and purification of the outer membrane protein TolC of the Tartarus, and the detection of TolC of the outer membrane protein of the tartaric fungus by Western blot, and the use of animals. The immune protection was evaluated by the experiment. The delayed Edward bacteria outer membrane protein TolC, which has the immune protection effect, lays the foundation for the further development of the subunit vaccine and the target selection of the nucleic acid vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC。
技术介绍
迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda,E.tarda)感染在水产养殖中十分普遍，能够引起多种海水和淡水鱼类感染发病，尤其是在我国鲽、鲆、鳗等经济鱼类产区危害严重，造成十分重大的损失。该菌1962年首次由日本学者从患红点病鳗鲡体内分离，此后发现其能够感染包括鱼类、两栖类、爬行动物、鸟类和哺乳动物在内的多种类型宿主动物。更应引起重视的是，E.tarda可以感染人，病型复杂，严重可诱发致死性败血症，近年来通过食源途径感染病例急剧增多，揭示其重要的公共卫生学意义。目前针对迟缓爱德华菌感染疫苗研究仍处于初步阶段，虽然目前已有获批生产的商用疫苗，但其多局限于鲆鱼使用，对其他鱼类效果未知。此外该菌疫苗的开发存在难以克服的问题，一方面灭活疫苗免疫效率低下，免疫效果差强人意；另一方面，基因工程减毒疫苗虽免疫效果优良，但安全问题不容忽视，因此，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点。其中，TolC是存在于革兰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在亚单位疫苗和核酸疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在亚单位疫苗和核酸疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达方法制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)pMD18-T-tolC载体的构建根据GenBank上发布E.tarda参考菌株ET-1基因组序列设计扩增tolC基因引物如下：引物P1：5'-ATGAAGAAACTGCTCCCTC-3'；SEQIDNO：1；引物P2：5'-TACGCCGCCGCCGGGGATC-3'；SEQIDNO：2；以E.tarda基因组为模板PCR扩增tolC基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-tolC，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌落进行PCR检测，阳性菌落进行序列测定，并分析其同源性；2)重组表达载体pET-32a-tolC的构建根据TolC蛋白特性，设计引物序列如下：P3：5'-CGGGATCCGAAAACCTGATGCAGGTATATC-3'，带有BamHⅠ酶切位点；SEQIDNO：3；P4：5'-GCGTCGACTACGCCGCCGCCGGGGATC-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQIDNO：4；以所述pMD18-T-tolC为模板，P3、P4为引物扩增目的基因，利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ分别对目的基因与pET-32a载体进行双酶切，将目的基因和pET-32a载体片段回收，连接，构建重组表达载体pET-32a-tolC，将所述重组表达载体pET-32a-tolC转入所述大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆进行PCR验证，所述阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定，确保无突变和移码；3)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达及验证将重组载体pET-32a-tolC和空载体分别转化到宿主菌中，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD600值为0.8-1.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h；4)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证方法为Westernblot检测；5)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化将所述阳性克隆重组菌株按所述步骤3)的条件进行扩大培养；并利用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，利用SDS-PAGE分析所述迟缓爱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志强，高桂生，吴同垒，史秋梅，肖丽荣，苏硕青，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北,13