一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC制造技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括，pMD18‑T‑pagC载体的构建，重组表达载体pET‑32a‑pagC的构建和重组蛋白原核表达；利用Western blot检测迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，以及使用动物实验评估其免疫保护力。通过本发明专利技术公开的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。

An outer membrane protein PagC of Edward bacillus with immune protection

The invention discloses the application of an immune protective effect of the outer membrane protein PagC of Edward bacteria in subunit vaccine. The recombinant protein is prepared by the prokaryotic expression method, including the construction of the pMD18 T pagC vector, the construction of the recombinant expression vector pET 32a pagC and the recombinant protein prokaryotic expression; The outer membrane protein PagC of Edward's bacillus was detected by Western blot and its immune protection was evaluated by animal experiments. The delayed Edward bacteria outer membrane protein PagC, which has the immune protection effect, lays the foundation for the further development of the subunit vaccine and the target selection of the nucleic acid vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC。
技术介绍
迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda,E.tarda)是水产养殖中十分常见的病原细菌，能够广泛引起多种海水和淡水鱼类感染发病，造成高死亡率和淘汰率，给水产养殖造成重大损失。此外，E.tarda也可以感染人，且病型复杂，严重可致败血症，危及生命，具有重要公共卫生学价值。针对水产上日益严重的迟缓爱德华菌感染问题，传统的抗生素和化学药剂已难以满足生产的需要，设计开发用于水产使用的疫苗是当前研究的热点。目前针对迟缓爱德华菌病疫苗的研制已经开展并取得了一定的成果，寻求更高效、使用更便捷的疫苗的研究也一直没有停止。对于E.tarda而言，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点。其中，PagC是存在于迟缓爱德华菌外膜的孔道蛋白，最初发现于伤寒沙门菌，是Ail/OmpX/PagC外膜蛋白家族成员。PagC蛋白不仅仅是结构性的外膜蛋白，还参与多种生物学功能，有研究表明，该蛋白受控于phoP-phoQ--双组份调控系统，与细菌的胞内存活和毒力密切相关，此外该蛋白还被报道参与细菌对抗血清杀伤作用以及外膜小泡的形成。但是，目前目前对迟缓爱德华菌PagC蛋白的研究较少，NCBI上登录的序列较少，对已登录的几种细菌pagC基因序列进行分析发现，该基因在同种属细菌间高度保守，但在不同种属细菌间差异极大，揭示该蛋白可作为诊断基因应用。因此，纯化迟缓爱德华菌PagC蛋白，制备出具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，利用原核表达系统对其表达纯化，通过动物实验评估该迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的免疫保护力，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。本专利技术利用外源表达的重组蛋白作为免疫原，更为安全，同时动物模型也确定了该蛋白的免疫保护效果。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用进一步地，所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达方法制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)pMD18-T-pagC的构建：根据E.tarda参考菌株ET-1基因组序列pagC基因设计引物，所述引物序列如下：P1：5'-GGAATTCATGAAAAAACAGATCGCTGGAC-3'，带有EcoRⅠ酶切位点；SEQIDNO：1P2：5'-GCGTCGACAAAACGGTAGCCGAGACCGACG-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQIDNO：2利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因；2)重组表达载体pET-32a-pagC的构建：利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-pagC载体进行双酶切，回收的pagC基因片段，构建重组表达质粒pET-32a-pagC，转化感受态细胞后挑取克隆进行PCR和双酶切验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码；3)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达：将重组载体pET-32a-pagC和空载体分别转化到宿主菌中，阳性克隆接种到液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h。进一步地，步骤2)中所述感受态细胞为DH5α。本专利技术在使用重组表达质粒pET-32a-pagC转化时，DH5a可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于筛选鉴别重组菌株。进一步地，步骤3)中所述宿主菌为BL21工程菌。进一步地，步骤3)中所述液体LB培养基为含有氨苄青霉素的液体LB培养基，其中所述氨苄青霉素的浓度为25-50μg/L。所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的鉴定方法为Westernblot检测；步骤如下：将权利要求1步骤3)中所述菌悬液离心收集菌体，超声裂解后收集沉淀和上清，利用SDS-PAGE分析蛋白表达，以His-Mab为一抗、山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Westernblot检测。进一步地，所述一抗浓度为1:600～1000；所述一抗浓度为1:2000～5000。所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC通过动物实验评估其免疫保护力；所述动物实验评估方法为：在动物免疫前后不同时间点，以眶下窦采取动物血液并分离血清，以超声破碎的所述迟缓爱德华菌全菌蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测动物血清中抗体的效价，以阴性血清OD450平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。本专利技术公开提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，至少有以下优点：(1)表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC能够被E.tarda阳性血清所识别，且在E.tarda自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即本专利技术中原核表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC对E.tarda感染具有较好的免疫保护力。(2)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC能够使机体产生较高水平特异性抗体，且在加强免疫后达到最高水平，本专利技术中的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC可在血清学诊断上进行应用。(3)本专利技术公开的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫小鼠后能够使95％的免疫小鼠得到保护，即本专利技术中的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在E.tarda疫苗研究中具有广阔的前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术提供的不同菌株pagC基因同源性分析；图2附图为本专利技术提供的PCR扩增E.tardapagC基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为Marker；泳道1为E.tardapagC基因；图3附图为本专利技术提供的SDS-PAGE分析迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在大肠杆菌中的表达；其中，泳道M为Marker；泳道1和泳道2为pET-32a-pagC/BL21；泳道3为pET-32a/BL21；图4附图为本专利技术提供的本专利技术提供的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的纯化效果电泳图；其中，泳道M为Marker；泳道1为纯化过的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC；图5附图为本专利技术提供的Westernblot鉴定迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在大肠杆菌中的表达；其中，泳道1为pET-32a-pagC/BL21；泳道2为pET-32a/BL21；图6附图为本专利技术提供的Westernblot分析阳性血清对迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的识别；其中，泳道1为迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC；2为阴性对照；图7附图为本专利技术提供的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC对小鼠的免疫保护效果；图8附图为本专利技术提供的免疫小鼠血清的抗体水平变化。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达方法制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)pMD18-T-pagC载体的构建根据E.tarda参考菌株ET-1基因组序列pagC基因设计引物，所述引物序列如下：P1：5'-GGAATTCATGAAAAAACAGATCGCTGGAC-3'，带有EcoRⅠ酶切位点；SEQIDNO：1P2：5'-GCGTCGACAAAACGGTAGCCGAGACCGACG-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQIDNO：2利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因，以pMD18-T作为质粒，构建pMD18-T-pagC载体；2)重组表达载体pET-32a-pagC的构建利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-pagC载体进行双酶切，回收的pagC基因片段，构建重组表达质粒pET-32a-pagC，转化感受态细胞后挑取克隆进行PCR和双酶切验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码；3)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达将重组载体pET-32a-pagC和空载体分别转化到宿主菌中，阳性克隆接种到液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h。3.根据权利要求2所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达方法制备方法，其特征在于，步骤2)中所述感...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志强，高桂生，吴同垒，史秋梅，苏硕青，李巧玲，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北,13